论文摘要
人类遗传性疾病、传染性疾病、癌症等威胁着人类的生命,这些疾病的早期诊断和治疗都依赖于对病源、基因检测和药物的研究。建立简单、敏感、特异和快速的病源、基因和药物检测方法,对疾病的预防、诊断和治疗具有重要的意义。生物传感器是生物分子识别单元（如酶、抗体或单链DNA）与信号转换元件偶联组成的分析器件,是简单廉价快速免疫检测和核酸检测的重要工具。生物传感器的研究已成为现代分析化学研究的前沿课题之一。在生物传感器生物分子识别元件中,酶和单抗或多抗的制备比较繁琐、固定时易损失活性、活性保存时间有限、使用时对环境和样品条件要求比较高,因此,利用新型高特异性高稳定性生物识别单元,建立高选择型高灵敏度的生物传感新方法,也成为当前分析化学研究一项具有挑战性的研究工作。适体具备类似抗体对靶分子高亲合力和特异性、分子量小、结构简单、易合成和可进行连接性修饰等优点,而且反应速度快、可反复使用和长期保存。因此,适体这些独特的优点使其被认为有望取代抗体或弥补抗体不足而成为新一代生物识别分子,适体传感器的研究已成为生物传感器研究中的研究课题。电化学发光法兼有电化学和化学发光法的双重优点,具有极低的检测限、极宽的线性范围等优点;相对于荧光法,无光漂白,不需要光源和分光系统等优点;相对于电化学检测,具有检测限低和受电极污染影响小的优点。本论文研究工作旨在基于纳米粒子信号放大作用,结合生物分子识别物质DNA和适体的特异性,研制高灵敏度、高选择性新型电化学发光DNA和适体生物传感器。本论文研究工作是在国家自然科学基金“电化学发光适配体生物传感器”（No.20775046）,“微阵列生物传感器信号化学放大基础研究”（No.90607016）和“新型功能纳米材料组装电化学发光生物亲合传感器的研究”（No.20375025）项目的资助和陕西师范大学优秀博士论文资助项目的资助下完成的。本论文研制了一种高灵敏度、高选择性、简单的新型电化学发光DNA杂交生物传感器;研制了一种简单、快速、灵敏的可卡因电化学发光适体生物传感器;研制了三种简单、快速、灵敏的凝血酶电化学发光适体生物传感器;还构建了非标记溶菌酶电化学发光适体传感器。本论文由五章组成。第一章为引言。引言部分介绍了电化学发光分析的原理、特点和电化学发光反应的机理;重点介绍了DNA与适体生物传感器的构造、原理、特点以及分析应用,总结了适体分子在电极上的几种主要固定方法;介绍了纳米材料作为电极修饰材料和探针载体的优点以及在DNA生物传感器中的应用;还简要介绍了本论文的目的和意义以及主要研究内容。第二章为电化学发光DNA杂交生物传感器的研究。本章研究工作旨在提高电化学发光DNA杂交检测的灵敏度,基于单壁碳纳米管负载大量钌联吡啶复合物标记,研制了一种超灵敏的电化学发光DNA杂交生物传感器。单链DNA探针（ss-DNA）和钌联吡啶复合物负载到单壁碳纳米管上,作为电化学发光探针。当修饰有巯基的捕获ss-DNA自组装到金电极表面,然后与目标ss-DNA进行杂交,进而与电化学发光探针杂交,形成DNA夹心结构,电化学激发后产生一个强的电化学发光响应信号。该传感器的电化学发光强度与完全互补目标ss-DNA浓度在2.4×10-14mol/L～1.7×10-12mol/L之间呈良好的线性关系,检出限为9×10-15mol/L。该传感器对完全互补目标ss-DNA和两碱基错配ss-DNA有一定识别作用。该工作表明单壁碳纳米管可以负载电化学发光探针,从而建立超灵敏的电化学发光DNA杂交生物传感器。第三章为可卡因电化学发光适体传感器的研究。以可卡因适体为分子识别物质,可卡因为目标分析物,钌联吡啶衍生物为电化学发光标记物,提出并设计了一种新型的基于适体的电化学发光检测小分子药物可卡因的适体生物传感器。3′末端标记有钌联吡啶衍生物的可卡因适体为电化学发光探针。通过巯基自组装将电化学发光探针固定到电极上制备成为电化学发光适体传感器。当目标物质可卡因存在时,适体折叠,三个双链茎与可卡因结合,适体发生构象转变,钌联吡啶衍生物离电极距离变近,电化学发光强度增强。电化学发光积分强度与可卡因浓度在5.0×10-9mol/L-3.0×10-7mol/L之间呈良好的线性关系,检出限为1×10-9mol/L。第四章为凝血酶电化学发光适体传感器的研究。本章的研究工作旨在设计基于适体的电化学发光检测蛋白质的适体生物传感器。以凝血酶适体作为分子识别物质,以凝血酶作为目标分析物,研制了三种简单、快速、灵敏的凝血酶电化学发光适体生物传感器。1.基于二茂铁淬灭钌联吡啶电化学发光设计了一种新型的检测凝血酶电化学发光适体传感器。首先自组装捕获探针到金电极上,捕获探针序列包括凝血酶适体和与DNA标记钌联吡啶（RuDNA）结合部分,随后将与RuDNA和二茂铁标记的DNA（FcDNA）探针依次完全互补单链DNA序列结合在固定化捕获探针序列上,构成传感器。在没有目标物质凝血酶存在时,由于FcDNA和RuDNA接近,产生电化学发光淬灭,得到较低的电化学发光响应信号;存在目标物质凝血酶时,由于FcDNA/凝血酶适体双链变为凝血酶适体/凝血酶复合物,电化学发光淬灭消失,产生一个增强的电化学发光响应信号。该传感器的电化学发光强度与凝血酶浓度在2.0×10-10mol/L～2.0×10-7mol/L范围内呈良好的线性关系,对凝血酶的检出限为6×10-11mol/L。实验结果表明,所设计基于二茂铁淬灭钌联吡啶电化学发光凝血酶适体传感器为信号增强型适体传感器,可有效的降低背景信号,提高检测蛋白质的灵敏度。2.利用适体在目标分子的引入时,使适体原本形成的DNA/DNA双螺旋结构转变为DNA/目标分子的复合物结构,发生构型转换机制,研制了一种用于高灵敏检测凝血酶的电化学发光传感器。首先在金电极表面通过1,6-己二硫醇自组装纳米金,再将巯基修饰的捕获探针组装在纳米金表面,该捕获探针与钌联吡啶衍生物标记的凝血酶适体探针杂交后,即组成传感器。凝血酶的存在使钌联吡啶衍生物标记的适体探针从电极表面脱落而导致电化学发光强度下降。该传感器可对凝血酶进行特异性识别与检测,其电化学发光强度与凝血酶浓度在2.7×10-12mol/L～2.7×10-9mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为8×10-13mol/L。该传感器有较高的灵敏度,可在水中热解后再生,稳定性良好。3.以碳纳米管作为信号物质载体,结合凝血酶的两段适体,构建了高灵敏的电化学发光适体传感器。将巯基修饰的凝血酶适体Ⅰ通过自组装到金电极表面,形成识别层,特异性“捕捉”目标蛋白质-凝血酶,进而结合电化学发光探针（碳纳米管负载凝血酶适体Ⅱ和钌联吡啶复合物）形成夹心结构,在含有三丙胺的检测液中通过检测电化学发光探针的电化学发光信号对凝血酶进行定量检测。实验证明,此传感器具有优异的特异性和超高的灵敏度,对凝血酶检出限可达3×10-15mol/L。第五章为非标记溶菌酶电化学发光适体传感器的研究。以溶菌酶适体作为分子识别物质,以溶菌酶作为目标分析物,基于Ru（bpy）32+静电结合到修饰有适体探针的电极表面,产生的电化学发光响应,设计了一种灵敏的非标记电化学发光溶菌酶适体传感器。通过表面结合阳离子电化学发光活性物质Ru（bpy）32+的电化学发光强度积分值对凝血酶进行识别和定量分析,电化学发光强度积分值与溶菌酶的浓度在6.4×10-10～6.4×10-7mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为1.2×10-10mol/L。探索建立了电化学发光测定溶菌酶适体与溶菌酶结合的解离常数。本论文所研制的电化学发光DNA和适体生物传感器,为DNA、小分子药物和蛋白质的快速灵敏检测提供了良好的分析器件和分析新方法。金纳米粒子提供相对大的比表面积,可以提高凝血酶适体在电极上的固定量,从而提高电化学发光检测凝血酶的灵敏度。碳纳米管可以负载有多个信号分子,从而使传感器检测DNA和凝血酶的灵敏度大大提高。本论文的研究工作为进一步研制高灵敏度和高选择电化学发光DNA和适体生物传感器提供了基础性研究资料,对此方面的研究工作具有一定的促进作用。