脂联素在皖南花猪免疫器官表达的发育规律及对免疫的影响

论文摘要

皖南花猪是我国地方优良品种猪之一，遗传品质和生产性能在中国猪种中有明显的独特性。脂联素是脂肪因子家族成员中一种重要的特异蛋白质，不仅通过多种途径参与调节机体糖、脂代谢，抑制炎症反应，还可作用于机体几乎所有器官及细胞，尤其是免疫细胞，参与机体免疫反应。脾脏作为全身最大的周围淋巴器官，参与全身的细胞免疫和体液免疫。是淋巴细胞和其他免疫细胞发生、分化成熟、定居、增殖及产生免疫应答的场所。淋巴结是机体最为重要的免疫器官，是接受抗原刺激产生免疫应答的场所，有过滤、增殖和免疫作用。本试验通过研究血清相关免疫指标发育性变化规律与脾脏和淋巴结脂联素基因表达发育性变化规律的联系，旨在探讨脂联素与皖南花猪免疫系统的内在关系。通过重组脂联素对猪脾细胞的影响，探讨脂联素对免疫系统的作用。试验动物选自安徽省黟县皖南花猪繁育中心，选取0，30，45（断奶），90，180日龄纯种皖南花猪每一日龄各10头，公、母猪各半，常规饲养管理，临床健康。饲养至各日龄屠宰，屠宰前禁食12h，称重。血液样品的采集：屠宰心脏采血。取脾脏称重后迅速转移到液氮，同样，取颈部淋巴结迅速转移到液氮，-80℃保存备用。采用ELISA方法测定皖南花猪血液中TNF-α、IL-6的水平，免疫比浊法测定血液中免疫球蛋白的水平，荧光定量RT-PCR方法测定脾脏、颈部淋巴结组织中脂联素（Adp）、脂联素受体1（AdpR1）和脂联素受体2（AdpR2）mRNA表达，脾脏、颈部淋巴结、皮下脂肪和内脏脂肪组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）mRNA表达。结果显示：1皖南花猪血清部分免疫指标生长发育性变化皖南花猪血清中细胞因子TNF-α和IL-6有极显著的发育性变化（P<0.01），45d后公母之间有显著或极显著的差异（P<0.05或P<0.01）。总体上血清IgG有极显著的发育性变化（P <0.01），血清中IgA只在母猪有极显著的发育性变化（P <0.01）， IgM没有明显的发育性变化。IgA和IgM在总体上没有显著的发育性变化，性别间比较显示，母猪IgA、IgG和IgM都显著大于公猪（P <0.05）。2皖南花猪脂联素及其受体与免疫相关基因的发育性变化及组织和性别差异（1） Adp mRNA在皖南花猪脾脏中有显著的发育性变化（P<0.05），且其表达量极显著低于颈部淋巴结（P<0.01）；AdpR1和AdpR2mRNA在皖南花猪脾脏和颈部淋巴结都有显著的发育性变化（P<0.05），其中AdpR2mRNA在颈部淋巴结中的表达量显著高于脾脏（P<0.05）。（2） TNF-α mRNA在皖南花猪颈部淋巴结和皮下脂肪的表达量有显著或极显著的发育性变化（P<0.05或P<0.01），TNF-α mRNA在脾脏中的表达量在断奶前显著高于颈部淋巴结（P<0.05），断奶后低于颈部淋巴结但不显著。总体上TNF-α mRNA在皮下脂肪的表达量高于内脏脂肪；IL-6mRNA在皖南花猪脾脏、颈部淋巴结、皮下脂肪、内脏脂肪的表达量都有显著或极显著的发育性变化（P<0.05或P<0.01），IL-6mRNA在脾脏中的表达量显著高于颈部淋巴结（P<0.05）。（3）皖南花猪脾脏和颈部淋巴结的Adp、AdpR1、AdpR2、TNF-α和IL-6mRNA表达在公、母猪间的差异不明显，在各个组织中只有个别日龄差异显著（P<0.05）； TNF-α和IL-6mRNA表达在皮下脂肪和内脏脂肪也有相似的情况。（4）在皖南花猪脾脏Adp与AdpR1mRNA表达量中度相关（r=0.39，P<0.05；）；在皖南花猪脾脏、颈部淋巴结和皮下脂肪TNF-α与IL-6mRNA表达量高度或中度相关（r=0.54，P<0.01；r=0.70，P<0.01；r=0.64，P<0.01）。以上结果表明：皖南花猪血液生化指标有特定的发育性模式，并存在不同程度的性别差异。Adp、AdpR1、AdpR2、TNF-α和IL-6调节机体的免疫过程可能存在相互作用。3重组脂联素对猪脾脏细胞的影响及其机制选择10日龄皖南花猪脾脏分离脾脏细胞，从第二天开始每天用MTT方法检测细胞活力，培养到第5天时用1、5、10和15μg/ml四个浓度重组脂联素三聚体分别进行短时（12h）和长时（24h）处理，用MTT方法检测各个浓度处理的细胞活力。分对照组，Adp组，Adp+NAC组，NAC组对脾脏细胞进行12h和24h处理，然后采用ELISA方法测定脾细胞上清液中TNF-α、IL-6的水平。结果显示，12h和24h时处理后，4个处理浓度组均降低细胞活力；细胞上清液中TNF-α、IL-6的含量水平显示，加入Adp后TNF-α和IL-6的含量水平都有下降趋势，但不显著（P>0.05），而Adp+NAC组TNF-α和IL-6含量水平都有上升趋势，其中，IL-6的含量水平在处理12h后Adp+NAC组显著高于Adp组。结果显示：重组脂联素三聚体处理猪脾脏细胞有降低细胞活力和抑制脾脏细胞分泌TNF-α和IL-6的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图和附表清单
• 论文中出现的中英文缩写词
• 文献综述
• 1 皖南花猪简介
• 2 脾脏的结构和功能
• 3 淋巴结的结构与功能
• 4 脂联素（Adiponectin）、脂联素受体的免疫功能及与细胞因子、免疫球蛋白的关系
• 4.1 脂联素
• 4.2 脂联素受体
• 4.3 TNF-α和 IL-6 在免疫中的作用
• 4.4 免疫球蛋白
• 4.5 脂联素对免疫功能的调控作用
• 5 本研究的目的意义
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物的饲养
• 1.2 样本采集
• 1.3 主要试验仪器及试剂
• 1.4 测定项目
• 1.4.1 屠宰指标测定
• 1.4.2 血清中相关指标水平的测定
• 1.4.3 荧光定量 RT-PCR 方法测定脾脏、颈部淋巴结组织中相关基因表达水平
• 1.4.4 皖南花猪脾脏细胞的培养
• 1.5 数据分析
• 2 结果
• 2.1 屠宰指标测定结果
• 2.2 皖南花猪血清 TNF-α和 IL-6 的发育性变化及性别差异
• 2.2.1 皖南花猪血清 TNF-α的发育性变化
• 2.2.2 皖南花猪血清 IL-6 的发育性变化
• 2.2.3 皖南花猪血清 TNF-α和 IL-6 发育性变化的性别差异
• 2.3 皖南花猪血清免疫球蛋白的发育性变化及性别差异
• 2.4 试验样品 RNA 质量的检测结果
• 2.5 cDNA 纯度鉴定
• 2.6 荧光定量 PCR 的扩增曲线，标准曲线的建立及其扩增产物特异性
• 2.6.1 荧光定量 PCR 标准曲线的建立及其扩增曲线
• 2.6.2 扩增产物的特异性
• 2.7 mRNA 表达的定量结果
• 2.7.1 Adp mRNA 的发育性变化及不同部位表达量的比较
• 2.7.2 AdpR1 mRNA 表达量的发育性变化及不同部位的比较
• 2.7.3 AdpR2 mRNA 表达量的发育性变化及不同部位的比较
• 2.7.4 TNF-α mRNA 表达量的发育性变化及不同部位的比较
• 2.7.5 IL-6mRNA 表达量的发育性变化及不同部位的比较
• 2.7.6 皖南花猪脾脏、颈部淋巴结、皮下脂肪和内脏脂肪基因表达的性别差异
• 2.8 皖南花猪脾脏、颈部淋巴结、皮下脂肪和内脏脂肪基因表达的相关性分析
• 2.9 脾细胞培养结果
• 2.9.1 脾脏细胞的形态
• 2.9.2 脾细胞生长曲线
• 2.9.3 rAdp 对猪脾细胞相对活力的影响
• 2.9.4 rAdp 对猪脾细胞分泌 TNF-α和 IL-6 的影响
• 3 讨论
• 3.1 脾脏重量的发育性变化
• 3.2 皖南花猪血清中 TNF-α、IL-6 及免疫球蛋白水平与机体免疫
• 3.3 皖南花猪脂联素基因的表达
• 3.4 皖南花猪脂联素受体基因的表达
• 3.5 脂肪组织与免疫
• 3.6 皖南花猪脾脏、颈部淋巴结、皮下脂肪和内脏脂肪中 TNF-α、IL-6 基因的表达
• 3.7 Adp 对皖南花猪脾脏细胞相对活力的影响
• 3.8 Adp 对皖南花猪脾脏细胞分泌 TNF-α、IL-6 的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的学术论文