钙结合蛋白D28k在小鼠肾脏发生发育中的表达

论文摘要

目的观察钙结合蛋白D28k（Calbindin-D28k）在小鼠肾脏发生发育中的表达规律及定位，探讨Calbindin-D28k在小鼠肾脏发生发育中的作用。方法选取体重25～30g健康成年昆明小白鼠，采用检查阴道栓脱落的方法确定其受孕后，选取胚龄（E）10、12、14、16、18天的胎鼠和生后日龄（N）1、3、7、14、21、40天的仔鼠，每组取8只鼠。将各胚（日）龄小鼠剖腹取出肾脏，常规制作石蜡切片。应用光镜技术（LM）对不同发育阶段的小鼠肾脏进行观察；应用免疫组织化学（IHC）染色（SABC法）及免疫荧光技术（IFT）对各组小鼠肾脏Calbindin-D28k表达进行定性观察；应用图像分析方法（CLAS-1000型细胞图像分析系统）对各组小鼠肾脏Calbindin-D28k表达进行定量检测；应用蛋白印迹技术（Western blotting）对不同发育阶段小鼠肾脏Calbindin-D28k表达进行定量测定。结果1光镜结果：胚龄12天，输尿管芽出现，在输尿管芽周围围绕生后肾组织。胚龄14天，生肾区出现，即在输尿管芽分支周围出现了小泡体、逗号小体、S小体。胚龄16天，Ⅲ、Ⅳ期肾小体出现。胚龄18天，早期髓质出现，其间散在大量间质，相当于成年后的髓质外带外区。生后1天，肾脏被膜下生肾区面积减少，可见肾乳头。生后7天，皮质生肾区消失，肾小体发育基本成熟，输尿管芽消失，髓放线出现，可见近直小管，远直小管和集合管，肾乳头可见髓质外带内区。生后14天，皮质增厚，髓质可区分为髓质外带内外区。生后21天，皮质厚度明显增加，肾乳头内侧可见髓质内带，集合管数量增多。生后40天，肾及肾小体的发育达到成年水平，髓质外带以及内带清晰与成鼠完全相同。2免疫组织化学染色结果：胚龄10天，Calbindin-D28k在胎鼠肾脏中未见表达。胚龄12天，Calbindin-D28k在输尿管芽有所表达，表达强度比较微弱，生后肾组织未见表达。胚龄14天，Calbindin-D28k在输尿管芽分支表达增强，生肾区未见表达。胚龄16天，Calbindin-D28k在输尿管芽壶腹表达强烈，肾小管和S小体未见表达，然而S小体与输尿管芽壶腹连接处表达。胚龄18天到生后3天，肾小囊、近端小管、髓袢未见表达，而远端肾单位表达增强。生后7天，Calbindin-D28k定位于肾脏的远曲小管、连接小管、皮质集合管。生后14天、21天、40天Calbindin-D28k在小鼠肾脏均有表达，其表达强度减弱且趋于稳定。Calbindin-D28k在小鼠肾脏的表达部位在细胞胞浆内。3 CLAS-1000型细胞图像分析系统检测：肾脏发育不同时期Calbindin-D28k表达的灰度值有明显的差异：胚龄12天，Calbindin-D28k表达的灰度值最高，Calbindin-D28k有一定表达。从胚龄12天到生后7天，Calbindin-D28k表达的灰度值降低，表达量逐渐增加，生后7天达高峰。从生后14天到生后40天，Calbindin-D28k表达量减少并趋于稳定，差异无显著性意义。4免疫荧光结果：Calbindin-D28k在胚龄10天胎鼠肾脏未见表达，胚龄12天在输尿管芽微量表达，胚龄14天在输尿管芽Y型分支表达，表达增强，胚龄16天在输尿管芽壶腹表达强烈，且在肾单位与输尿管芽壶腹连接部有少量表达。胚龄18天到生后7天，Calbindin-D28k表达逐渐增强，并定位于远曲小管、连接小管、皮质集合管。生后7天到生后40天，Calbindin-D28k在远曲小管、连接小管、皮质集合管表达丰富，在髓质集合管表达下降。Calbindin-D28k表达部位在输尿管芽或远曲小管、连接小管、皮质集合管上皮细胞胞浆内。5 Western blotting结果：胚龄12天，Calbindin-D28k表达量极低，无法检测。胚龄14天到胚龄16天，Calbindin-D28k表达量增加，差异有显著性意义[（12.0994±0.6911），（13.2383±0.1729），P＜0.01]。胚龄16天到胚龄18天，Calbindin-D28k表达量无显著性差异。胚龄18天到生后7天，Calbindin-D28k表达量明显增加，差异有显著性意义[（13.8447±0.2385），（15.2718±0.2019），（16.3208±0.2839），（19.3383±0.4044），P＜0.01]。生后7天到生后14天，Calbindin-D28k表达量减少，差异有显著性意义[（19.3383±0.4044），（15.8915±1.0185），P＜0.01]。生后14天到生后40天，Calbindin-D28k表达量无显著性差异。结论1．在小鼠肾脏发生发育中，Calbindin-D28k在胚龄12天胎鼠肾脏输尿管芽微弱表达，随胚（日）龄增加其表达量逐渐增加，生后7天达最大水平，并定位于远曲小管、连接小管和皮质集合管，此后表达量减少并趋于平稳。2．Calbindin-D28k表达部位在输尿管芽或远曲小管、连接小管、皮质集合管上皮细胞胞浆内。3．Calbindin-D28k在肾脏发育中的表达规律及定位与肾钙重吸收过程中细胞内钙转运密切相关，可能对钙离子转运调节发挥重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料与设备
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 动物选择和胚（日）龄计算
• 2.2 光镜标本的制作
• 2.3 免疫组织化学法检测Calbindin-D28k
• 2.3.1 染色步骤
• 2.3.2 结果判定
• 2.3.3 免疫组织化学染色图象分析
• 2.4 免疫荧光法检测Calbindin-D28k
• 2.4.1 染色步骤
• 2.4.2 结果判定
• 2.5 Western blotting定量检测Calbindin-D28k
• 2.6 统计分析
• 结果
• 1 光镜结果
• 2 免疫组织化学染色结果
• 3 免疫组织化学染色图象分析结果
• 4 免疫荧光结果
• 5 Western blotting定量检测结果
• 讨论
• 1 肾脏的发生发育
• （1） 肾单位的发生发育
• （2） 集合管的发生发育
• 2 Calbindin-D28k在肾脏发生发育中的表达
• 小结
• 附图
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 致谢
• 附录
• 附录1 综述 钙结合蛋白D28k在肾脏发生发育中的研究进展
• 附录2 缩写词表