稳定表达牛Nanog基因的成纤维细胞制作、多能性分析及转基因克隆胚胎构建

论文摘要

ES细胞具有自我更新和多向分化潜能,是遗传操作、发育生物学和疾病模型极具价值的研究工具。家畜的ES细胞建系可用于人类遗传疾病模型制作和细胞移植治疗;还可应用于旨在改进家畜自身的生产性能,进而提高畜产品的质量的畜种改良、抗病育种和生物制药这些应用研究领域。尽管在二十多年前就建立了小鼠的ES细胞系,在二十世纪九十年代建立了灵长类ES细胞系,但目前还没有建立真正的家畜ES细胞系。本研究通过遗传修饰的方法,将维持ES细胞多能性的转录因子导入牛皮肤成纤维细胞,获得稳定转染的细胞株,再用这些转基因的供核细胞构建克隆胚胎,试图为家畜ES细胞建系开辟一条新途径。经过试验,取得了以下研究成果。（1）本研究通过RT-PCR方法从胎牛原始生殖嵴总RNA中扩增、克隆了牛Nanog基因全长cDNA,序列分析表明该段基因由903个核苷酸碱基组成,与牛Nanog编码序列进行BLAST联配分析,同源性为99.9%,只有第170位碱基发生了错义突变（T→C）,第58位编码氨基酸由苏氨酸（Thr）变为异亮氨酸（Ile）。（2）成功构建了pGEX-KG-Nanog原核表达重组质粒,转化大肠杆菌JM109, IPTG诱导表达后,获得了约60KD的表达产物,表达产物的分子量大小与预期的GST-Nanog融合蛋白大小相符; Western blotting免疫印迹试验表明表达产物可以与GST抗体发生特异性结合,表明表达的目的蛋白具有反应原性。为制备牛Nanog多克隆抗体奠定了基础。（3）成功构建了pEGFP-Nanog、pFLAG-Nanog真核表达重组质粒,在脂质体介导下转染皮肤成纤维细胞,并经G418筛选,分别获得了3株和1株稳定转染的细胞株。（4）稳定转染的细胞经RT-PCR检测均表达Nanog mRNA;经western blotting检测,表达EGFP-Nanog融合蛋白（60KD）的和FLAG-Nanog（34KD）融合蛋白,表明牛Nanog基因在皮肤成纤维细胞中成功表达。（5）稳定表达FLAG-Nanog和EGFP-Nanog的细胞株,经免疫染色鉴定,除了表达Nanog外,还表达Oct-4和胚胎干细胞表面抗原SSEA-4。（6）流式细胞仪检测干细胞表面标志发现,表达FLAG-Nanog的成纤维细胞其CD71、CD29和CD11a阳性率比未转染的成纤维细胞分别高67%、2.5%和7%。（7）经悬浮培养,表达FLAG-Nanog的成纤维细胞能形成典型的类胚体,RT-PCR检测发现这些类胚体表达三个胚层细胞的分化标志基因。（8）多能性检测试验数据表明,稳定表达Nanog基因的细胞具有一定的多能性。（9）核移植试验发现,未转染Nanog基因的成纤维细胞（BEF422）构建的克隆胚胎卵裂率（82.14%）远远高于转基因的克隆胚（40.38%和52.94.0%）（p<0.05）,差异显著,但前者的囊胚率（14.29%）与后两者（12.82%和11.76%）接近（p>0.05）,差异不显著。说明表达多能性转录因子Nanog的成纤维细胞与未经遗传修饰成纤维细胞所构建的克隆胚胎卵裂后具有同样的发育潜能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 NANOG 基因和ES 细胞多能性研究进展
• 1.1 NANOG 基因的发现
• 1.2 NANOG 基因结构
• 1.3 NANOG 基因的表达
• 1.4 NANOG 基因的功能
• 1.4.1 Nanog 与ES 细胞多能性维持
• 1.4.2 Nanog 与自我更新
• 1.4.3 Nanog 与肿瘤发生
• 1.4.4 Nanog 与体细胞重编程
• 1.5 多能性胚胎细胞系和ES 细胞产生
• 1.6 ES 细胞的增殖和分化
• 1.7 通过抑制ES 细胞分化进行自我更新
• 1.8 通过增殖促进ES 细胞自我更新
• 1.9 ES 细胞维持自我更新的分子机制
• 1.10 自我更新的转录因子网络
• 1.11 确定ES 细胞多能性的分子机制
• 1.12 建立体细胞的多能性
• 1.13 OCT-3/4, SOX2, C-MYC 以及 KLF4 引发的重编程
• 1.14 OCT-3/4, SOX2, C-MYC 以及 KLF4 的功能
• 1.14.1 Oct-3/4 的功能
• 1.14.2 Sox2 的功能
• 1.14.3 c-Myc 的功能
• 1.14.4 Klf4 的功能
• 1.14.5 因子诱导多能性干细胞的机制
• 第二章 有蹄类家畜胚胎干细胞研究进展及面临的挑战
• 2.1 家畜ES 细胞系
• 2.2 ES 细胞系的界定
• 2.3 ES 细胞的培养特性
• 2.4 ES 细胞的分子标志
• 2.5 有蹄类家畜ES 细胞建系面临的挑战
• 2.5.1 ES 细胞识别
• 2.5.2 分离和原代培养的时间选择
• 2.5.3 细胞克隆的传代
• 2.5.4 自发分化
• 2.5.5 诱导分化,
• 2.6 可能的解决途径
• 2.6.1 遗传操作
• 2.6.2 细胞因子和培养条件
• 试验研究
• 第三章 牛NAONG 基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要实验材料和试剂
• 3.2.3 常用溶液配制
• 3.2.4 目的片段克隆与测序
• 3.2.5 牛Nanog 基因原核表达载体构建
• 3.2.6 重组质粒在大肠杆菌中诱导表达
• 3.2.7 表达产物的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 牛Nanog 目的片段克隆与测序
• 3.3.2 原核表达载体构建和鉴定
• 3.3.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.3.4 Nanog 蛋白免疫印迹（Western blotting） 检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 牛NANOG 基因克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器设备
• 4.2.2 主要实验材料和试剂
• 4.2.3 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 Nanog 真核表达载体的构建
• 4.3.2 G418 对牛皮肤成纤维细胞最小致死量的确定
• 4.3.3 pEGFP-Nanog 和pFLAG-Nanog 质粒稳定转染的阳性细胞株筛选
• 4.3.4 牛Nanog 基因在皮肤成纤维细胞中的m RNA 表达
• 4.3.5 GFP/FLAG-Nanog 融合蛋白在成纤维细胞中的表达
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 转基因供核细胞的多能性检测及核移植
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要仪器设备
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 免疫染色
• 5.3.2 流式细胞仪检测干细胞表面标志
• 5.3.3 类胚体形成和三个胚层分化标志检测
• 5.3.4 转基因克隆胚胎的体外发育
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 本研究的创新点与进一步研究的课题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介