论文题目: CHO-dhfr细胞改造的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 许凌峰
导师: 俞炜源
关键词: 细胞培养,凋亡,乳酸,增殖抑制
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: CHO-dhfr-细胞表达体系是重要的药用蛋白表达体系,但其在培养过程中存在着一系列的问题,为了使其具有更适应大规模培养的特性,我们利用Flp定点整合系统,通过在CHO-dhfr-细胞中稳定整合调控基因对CHO-dhfr-细胞进行了的改造。首先在CHO-dhfr-细胞中定点整合并过表达人抗凋亡基因Bc1-2,获得的重组细胞对诱导凋亡因素的耐受能力增强,凋亡水平降低,增加了对无血清和高氨离子浓度不利培养条件。乳酸是细胞的重要代谢产物,其积累可明显影响细胞的生长和对外源蛋白的表达。为了减少细胞内乳酸的积累,选择了四个CHO-dhfr-细胞LDH-A基因中RNAi位点,设计了可转录产生相应shRNA片段的DNA序列,克隆于表达载体pAV/U6的下游。通过将shRNA表达载体在CHO-dhfr-细胞中稳定整合使之持续表达针对CHO-dhfr细胞LDH-A基因的shRNA,在建立的四株重组细胞中,筛选到一株具有较低的乳酸脱氢酶的mRNA的细胞株,获得的重组细胞株CHO-shRNA能降低乳酸的产生和在培养基中的积累,使细胞的凋亡水平降低,提高了细胞贴壁培养密度11.4%。我们的第三方面工作是实现对细胞增殖进行调控,因为细胞在培养过程中的过度增殖不利于外源蛋白的产生,当细胞达到最佳密度后,生长的停滞将有利于提高外源蛋白的生产。为了实现对细胞生长调控蛋白P27表达的调控以实现细胞生长的停滞,利用T-RExTM（四环素诱导）诱导表达系统,通过两步重组来达到建立稳定整合并可诱导表达p27基因的重组细胞株的目的,首先筛选了高表达TetR的重组细胞株,在此基础上,定点整合了受TetO2调控之下的p27基因,以实现对p27基因的诱导表达和对细胞周期的控制,在p27诱导表达的情况下,有效的抑制细胞周期停滞于G1期,通过对EGFP检测,表明在细胞生长停滞条件下,细胞对外源蛋白的表达水平可提高70%。
论文目录:
英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分 抗凋亡细胞株CHO-Bcl-2的建立
第二部分 低乳酸表达细胞株CHO-shRNA的建立
第三部分 诱导表达p27基因的细胞株CHO-p27的建立
总结
参考文献
综述
致谢
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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