禾谷镰刀菌多菌灵抗药性群体演变及DON毒素产生规律研究

论文摘要

小麦赤霉病是全球性危害小麦的最重要病害之一,禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是我国小麦赤霉病的最重要的病原菌。禾谷镰刀菌侵入小麦后可以分泌产生对人和动物均有毒的次生代谢物脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON,又称致吐毒素）。所以小麦赤霉病不但能引起小麦减产,还威胁人们的健康。DON毒素在发生小麦赤霉病的病麦谷中及其加工制品（如面粉,馒头,啤酒等）和以病麦谷为饲料的动物制品中（如肉,奶,蛋）中广泛存在,可引起人畜的急慢性中毒。国际上,选用抗病品种和化学防治仍然是小麦赤霉病最重要的防治方法之一。国内外关于小麦品种抗性对小麦中DON毒素浓度影响的报道,所得到的结果是不一致有时甚至是相互矛盾的。在中国,多菌灵是防治小麦赤霉病最重要和最常用的化学药剂之一然而,多菌灵在我国已经使用30多年了,田间禾谷镰刀菌对多菌灵的抗性水平及使用价值急需监测和评估。监测禾谷镰刀茵对多菌灵的抗性水平,评估多菌灵在防治小麦赤霉病的使用价值可促进抗药性治理。DON毒素主要由禾谷镰刀菌在小麦抽穗扬花期侵入小麦后在小麦收获前分泌产生的。小麦品种对赤霉病的抗病程度,禾谷镰刀茵的菌株分泌毒素的能力和化学防治能够影响麦谷中赤霉毒素的浓度。小麦麦谷中DON毒素浓度在储存期间的变化情况报道较少。本研究结合国内外对小麦赤霉病和DON毒素研究的最新进展,通过对国内小麦赤霉病的发生和防治规律监测和观察中。进行了如下研究：1.小麦品种抗性和禾谷镰刀菌互作对麦谷中DON浓度的影响在六个对小麦赤霉病具有不同抗病性的小麦品种上,接种6个G zea8单孢分离菌株。利用实时定量PCR技术分析相同菌株,相同病粒严重度的相同病粒率的6个小麦品种的麦谷中禾谷镰刀茵的生物量,使用电子捕获器检测的气谱分析方法考察小麦品种抗病性,禾谷镰刀菌菌株和赤霉病的发病程度对麦谷中DON浓度的影响。接种相同菌株,相同病粒发病严重度（DKS）下,相同病粒率（FDK）的六个不同抗病性的小麦品种的麦谷中,禾谷镰刀菌的生物量没有显著差异。接种相同菌株相同病粒严重度的相同病粒率的6个对赤霉病抗性具有显著差异的小麦品种的麦谷中,DON毒素浓度没有显著差异,这与以前的报道不一致。研究表明,不同病原菌菌株的产生DON毒素的能力具有极显著的差异。在接种2021的小麦望水白品种上,麦谷中DON毒素浓度（Y）和病粒率（x=0-20%）的理论曲线方程是Y=3.82X0.86（R2=0.9322F=219.8366 P<0.0001）。在接种B4-1菌株的冬小麦品系DH050上,麦粒中毒素含量（Y）与病粒率（X=0-50%）的理论曲线方程是Y＝1.06X1.32（R2=0.9531,F=325.04,P<0.0001,X=0-50%）。本研究表明小麦品种对赤霉病的抗病性对DON毒素的产生没有显著的影响；首次报道了小麦中的DON毒素浓度与小麦病粒率并不是线性关系。2.小麦食品DON毒素含量调查利用电子捕获气谱分析调查了2006年9月-2007年4月间南京市场上74种含小麦的食品中单端孢霉烯类毒素的DON,3ADON,15ADON的含量。检测结果表明：在调查的小麦制品食品中单端孢霉烯类毒素DON、3ADON和15ADON的检测率分别是75.7%,8.1%和21.6%,毒素浓度范围分别在0-11.38,0-1.47和0-2.06 mg/kg之间,平均浓度分别为1.80,0.06和0.11 mg/kg。在方便面,饼干,面包和蛋糕里DON的平均浓度分别为1.95,2.25,0.62和0.31mg/kg。37个样品即总数50%的样品中致吐毒素浓度大于我国关于粮食中致吐毒素含量的国家限制标准1mg/kg。产自福建、上海、广东、浙江、安徽、江苏、天津、北京、河北和山东的食品中毒素含量的平均值分别是2.12,2.39,3.50,1.86,1.72,1.22,0.65,0.27,1.55和0.00 mg/kg,。研究表明：在南京市场上调查期间的小麦食品单端孢霉烯族毒素类毒素含量存在超标问题,食品中DON毒素威胁着人民健康。3.DON毒素对小麦赤霉病损失率评估和防治指标研究在大田自然发病和单花滴注接种的发生赤霉病8个小麦品种上,研究小麦赤霉病的发生程度和小麦产量损失率的相关关系,利用气相色谱的方法测定不同发病程度的麦谷中DON毒素浓度,考察小麦赤霉病发生程度与DON毒素浓度的相关关系。麦谷中小麦赤霉病病粒率和小麦产量呈极显著的线性关系（r2=0.45-0.92）,直线斜率在1.99-3.57之间。在自然发病的小麦豫麦18上,麦谷中DON毒素含量（Y）与病粒率（X）的关系Y=-9.99+1.76X（R2=0.77,P<0.001）。在自然发病的皖麦18中,病粒率（X）与毒素浓度（Y）的关系式是Y=16.4+1.39X（R2=0.75,P<0.001）。根据小麦赤霉病引起的产量损失,小麦赤霉病的防治指标为病粒率2.8-7.5%,或者是小麦乳熟期的病情指数为2.4-8.7%。根据小麦麦谷中毒素含量造成小麦价值损失,小麦赤霉病的防治指标应为麦粒中DON毒素浓度为1mg/kg的病害严重度,即病粒率0.6%-3.1%,或者是乳熟期病情指数0.4-3.2%。研究表明,小麦赤霉病引起麦谷中DON毒素污染造成的小麦价值损失大于其造成的产量损失。4.禾谷镰刀菌多菌灵的抗药性监测及其群体演变规律研究调查了江苏省1994-2007年小麦赤霉病的发生危害程度,监测了江苏省1985-2008年禾谷镰刀菌田间抗多菌灵的抗性菌株频率,分析了田间出现抗性禾谷镰刀菌后,禾谷镰刀菌抗多菌灵菌株频率与小麦赤霉病发生程度,气象因子的相关关系。小麦赤霉病在江苏省的苏南江浦等县中度流行以上的年份达到30.8%,而在江苏北部赣榆,高邮等县,小麦赤霉病中发生以上的年份占7.7%-15.4%。禾谷镰刀菌抗药性菌株频率的增减率与江苏省小麦赤霉病的发病程度,小麦赤霉病的病情指数和江苏省小麦抽穗期四月中下旬的雨日呈极显著的相关关系。禾谷镰刀菌抗多菌灵菌株频率增减率（Y）与小麦赤霉病发病程度（X1）,赤霉病病情指数（X2）和四月中下旬雨日（X3）的关系式是Y=1.49X1+0.25X2-0.02X3-1.59。当赤霉病发生程度高于轻发生时,农民使用多菌灵防治赤霉病的用药量增加,田间对多菌灵产生抗药性菌株频率较上一年度增加,反之,抗药性菌株的频率将会减少。本研究表明在农业生产上多菌灵对小麦赤霉病的防治仍然具有使用价值。5.禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的温度敏感性分别测定田间分离的160个对多菌灵具有不同抗性水平的禾谷镰刀菌单孢分离菌株在不同温度下抗性程度的差异；测定5个抗性菌株在不同温度下的EC50；测定禾谷镰刀菌在PSA培养基和小麦琼脂培养基上的EC50。22个高抗菌株在10℃时变成中抗菌株,具有冷敏感性。9个低抗菌株在5℃时变成敏感菌株,具有冷敏感性。两个菌株在不同的温度条件下其EC50有极显著的差异,而3个菌株在不同的温度条件下EC50没有显著的差异。小麦琼脂培养基和马铃薯琼脂培养基测定菌株的EC50没有显著的差异,用苏麦3号小麦做的培养基与其他品种的小麦粉做的培养基测定EC50没有显著差异。本研究表明：19%的对多菌灵具有抗性的禾谷镰刀菌菌株具有温度敏感性,81%的抗多茵灵的禾谷镰刀菌菌株没有显著的温度敏感性。用PSA培养基和用小麦琼脂培养基测定禾谷镰刀菌对多菌灵的EC50没有显著差异。6.常温储存下小麦中DON毒素含量变化的变化规律研究使用电子捕获气谱分析法考察常温储存条件对病小麦中致吐毒素含量变化的影响,测定含有致吐毒素的小麦面粉在常温储存10个月的过程中每个月的致吐毒素浓度。储存前DON浓度是8.83±1.75mg/kg,储存期DON毒素平均浓度分别为6.66,7.33,6.08,7.90,5.45,6.56,7.29,8.02,6.82和8.60 mg/kg。统计分析结果表明小麦面粉中的DON毒素在本实验中的常温常规储存条件下没有显著差异。说明在常温储存条件下,小麦中的致吐毒素没有发生显著的变化。

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摘要

ABSTRACT

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前言

第一部分文献综述

第一章禾谷镰刀菌与小麦赤霉病研究进展

1.1 禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的主要病原菌

1.2 小麦赤霉病的发生流行

1.2.1 小麦赤霉病的初侵染源

1.2.2 小麦赤霉病的流行

1.3 小麦赤霉病的防治

1.3.1 选用抗病品种

1.3.2. 化学防治

参考文献

第二章禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的现状及机制

2.1 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的测定方法及敏感性基线

2.2 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性监测

2.3 多菌灵的作用机理

2.3.1 多菌灵的作用机理

2.3.2 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的遗传机制

2.3.3 多菌灵抗药性的分子机制

2.3.4 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的分子机制

2.3.5 抗性治理

参考文献

第三章禾谷镰刀菌产生毒素种类及规律

3.1 禾谷镰刀菌分泌的毒素种类及其毒性

3.1.1 单端孢霉烯族化合物及其毒性

3.1.2 玉米赤霉烯酮毒素及其毒性

3.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的毒理

3.2.1 DON的理化性质

3.2.2 DON毒性

3.2.3 DON对人类的毒性

3.3 DON毒素产生规律

3.3.1 禾谷镰刀菌产毒化学型

3.3.2 小麦品种对禾谷镰刀菌DON毒素产生的影响

参考文献

存在问题和本研究的意义

第二部分研究报告

第一章小麦品种抗性和禾谷镰刀菌互作对麦谷中DON毒素的影响

1.1 材料与方法

1.1.1 试验设计

1.1.2 品种（系）抗病程度调查

1.1.3 样品的选择

1.1.4 实时定量PCR测定麦谷中禾谷镰刀菌量

1.1.5 毒素检测

1.1.6 统计分析

1.2 结果与分析

1.2.1 小麦品种（品系）抗性对小麦籽粒中毒素浓度的影响

1.2.2 小麦品种（品系）抗性对禾谷镰刀菌量的影响

1.2.3 不同菌株的产毒能力

1.2.4 小麦病粒率和DON毒素浓度的关系

1.3 讨论

1.3.1 本研究在参试小麦品种上没发现第Ⅲ类型和第Ⅳ类型的抗性

1.3.2 小麦病粒率和DON毒素浓度不是线性关系

1.3.3 取样方法可能影响实验结果

1.3.4 不同菌株分泌毒素的能力具有极显著的差异

1.4 结论

参考文献

第二章小麦食品中DON毒素含量调查

2.1 材料与方法

2.1.1 样品的采集

2.1.2 化学试剂

2.1.3 样品的准备

2.1.4 色谱条件

2.1.5 毒素浓度分析

2.1.6 统计分析

2.2 结果与分析

2.2.1 含小麦食品单端孢霉烯族类毒素浓度

2.2.2 不同产地小麦食品中单端孢霉烯族类毒素浓度

2.2.3 不同食品种类的单端孢霉烯族类毒素浓度

2.2.4 DON毒素浓度

2.3 讨论

2.3.1 单端孢霉烯族类毒素来源于小麦赤霉病病粒

2.3.2 食品加工过程影响DON毒素浓度

2.3.3 DON毒素威胁人们健康

2.4. 结论

参考文献

第三章小麦赤霉病DON毒素损失率评估及防治指标研究

3.1 材料与方法

3.1.1 自然发病条件下的小麦赤霉病发病程度及产量损失率

3.1.2 人工接种条件下小麦赤霉病发病程度及产量损失率

3.1.3 DON毒素浓度的测定

3.1.4 统计分析

3.2 结果及分析

3.2.1 病情指数、小麦病粒率与小麦产量的关系

3.2.2 小麦病粒率与毒素浓度的关系

3.2.3 小麦赤霉病的防治指标的确定

3.3 讨论

3.3.1 小麦赤霉病的损失率的计算

3.3.2 根据DON浓度制订小麦赤霉病防治指标

3.3.3 DON毒素污染造成的损失大于小麦产量的损失

3.4 结论

参考文献

第四章禾谷镰刀菌多菌灵的抗药性监测及其群体演变规律研究

4.1 材料与方法

4.1.1 培养基的配备

4.1.2 禾谷镰刀菌标本的采集

4.1.3 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性鉴定

4.1.4 小麦赤霉病发生程度调查和气象资料的来源

4.1.5 统计分析

4.2. 结果及分析

4.2.1 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性频率

4.2.2 江苏省小麦赤霉病发生程度

4.2.3 影响禾谷镰刀菌多菌灵抗药性频率的相关因子

4.2.4 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性频率的预测

4.3 讨论

4.3.1 禾谷镰刀菌多菌灵抗性菌株是由药剂的选择压力产生的

4.3.2 禾谷镰刀菌不容易产生对抗多菌灵抗性的菌株,多菌灵仍可作为防治小麦赤霉病的有效药剂

4.3.3 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的演变规律

4.4 结论

参考文献

第五章禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的温度敏感性

5.1 材料与方法

5.1.1 培养基的配备

5.1.2 抗性菌株的来源

5.1.3 单孢菌株的分离

5.1.4 温度对禾谷镰刀菌抗性程度的影响

5.1.5 温度对抗性菌株有效抑制中浓度EC50的影响

5.1.6 营养条件对禾谷镰刀菌抗药性程度的影响

5.2. 试验结果

5.2.1 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性的温度敏感性

5.2.2 温度对不同抗性菌株EC50的影响

5.2.3 营养条件对病原菌抗性程度的影响

5.3. 讨论

5.3.1 禾谷镰刀菌多菌灵抗药性存在温度敏感性现象

5.3.2 营养条件影响禾谷镰刀菌的抗性

5.3.3 大田防治时可以利用禾谷镰刀菌温度敏感性

参考文献

第六章常温储存下小麦中DON毒素含量的变化规律研究

6.1 材料和方法

6.1.1 样品的选择

6.1.2. 面粉水分含量的测定

6.1.3 气象资料的搜集

6.1.4 毒素含量的测定

6.1.5 统计分析

6.2 结果与分析

6.2.1 储存期面粉DON毒素浓度的变化

6.2.2 面粉含水量的测定

6.2.3 月平均气温的变化关系

6.3 讨论

6.3.1 常温条件下小麦贮存期内的DON毒素浓度没有显著变化

6.3.2 气温影响储存期小麦含水量

6.4 结论

参考文献

第七章结论与创新点

7.1 结论与讨论

7.2 创新说明

7.3 工作展望

致谢

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