论文摘要
前言Wnt/β-catenin信号通路在从水螅到人等动物的胚胎发育和干细胞维持中其重要作用。该通路的关键环节是调节细胞浆内β-catenin的稳定性。在没有Wnt信号的情况下,由APC、Axin、GSK3β和CKIα等组成的复合物能识别细胞内的游离β-catenin并介导它通过磷酸化依赖的泛素-蛋白酶体系统快速降解,从而使细胞内游离的β-catenin保持在极低的水平。这时候TCF/LEF转录因子在细胞核内与转录抑制因子结合,从而抑制Wnt下游靶基因的表达。当细胞外Wnt分子达到一定浓度时,Wnt分子与细胞膜受体Frizzled（Fz）结合并使之激活。激活的Fz能促进细胞浆内的Dishevelled（Dvl）在细胞膜处多聚化并与LRP5/6结合形成配体-受体复合物而募集Axin至细胞膜处或促进其降解。此时,APC、Axin、GSK3β和CKIa等组成的降解复合物解散或形成减少,β-catenin的磷酸化和降解过程被抑制,从而导致细胞内游离β-catenin水平升高并在细胞浆内蓄积,进而入核与TCF/LEF转录因子结合,从而激活Wnt靶基因的转录。与细胞增殖和细胞周期相关的基因如c-myc、cyclin D1等已被证实为Wnt/β-catenin通路的靶基因。此外,许多研究发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可以导致包括肿瘤在内的许多疾病的发生,如大肠癌及肝癌等。虽然β-catenin在许多肿瘤中存在异常表达,但是β-catenin基因的突变却并不常见,因此Wnt/β-catenin通路的激活可能是由于β-catenin上游分子的改变导致。Dishevelled（Dvl）是Wnt/β-catenin信号通路中位于β-catenin上游的正向调节因子,其在Wnt/β-catenin通路中的作用机制仍不清楚。人类Dishevelled基因家族有DVL1、DVL2和DVL3三个成员,分别定位于染色体1p36、17p13.2和3q27。它们编码的三种蛋白（Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3）均包含高度保守的DIX、PDZ和DEP三个基本结构域。最近有研究报道乳腺癌、前列腺癌、宫颈鳞状细胞癌、大肠癌和肺癌中存在Dvl的过表达并提示Wnt/β-catenin通路可能存在异常激活,但这些研究结果存在争议,而且研究的样本量很小。此外,Dvl在肿瘤中的表达与临床病理因素之间是否存在相关性,尚不清楚。本课题主要研究非小细胞肺癌中Dvl家族各成员的表达情况,分析它们与肺癌患者临床病理因素和β-catenin表达的关系,同时探讨Dvl过表达对肺癌细胞β-catenin表达及侵袭能力的影响。旨在揭示Dvl和Wnt/β-catenin信号通路在肺癌发生发展中的作用。实验材料与方法113例非小细胞肺癌患者的原发灶组织及其中39例患者的配对淋巴结转移癌组织标本收集自中国医科大学附属第一医院病理科2003～2006年存档蜡块。原发灶蜡块均包含正常肺上皮组织。113例患者中,男性68例,女性45例,男女性别比1.5:1。手术切除时患者年龄20～81岁（中位年龄57岁）。按UICC（2002年）肿瘤TNM分期标准:Ⅰ期27例,Ⅱ期24例,Ⅲ期56例,Ⅳ期6例。按WHO（2004年）肺癌分类标准:鳞状细胞癌48例,腺癌65例。所有病例术前均未接受过放、化疗。我们采用免疫组化SP法检测了这113例标本中总Dvl、Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白的表达,同时对其中39例患者原发灶和淋巴结转移灶配对标本的Dvl和β-catenin蛋白表达进行对比分析。此外,我们在Dvl-2有一定丰度表达而Dvl-1和Dvl-3低/无表达的A549肺腺癌细胞系和QG56肺鳞癌细胞系中过表达Dvl-1和Dvl-3后,通过间接免疫荧光染色、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫印迹（Western blotting）和基质胶侵袭实验等方法检测了外源性Dvl-1和Dvl-3表达对β-catenin表达及肺癌细胞侵袭能力的影响。实验结果分化成熟的正常支气管上皮和肺泡上皮总Dvl蛋白及Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3均呈阴性表达。而肺癌组织中总Dvl阳性表达率为53.1%（60/113）,在腺癌中的表达高于鳞癌（p＜0.01）,并与肺癌低分化有关（p＜0.05）。肺癌中总Dvl的表达与高pTNM分期有关（Ⅲ-Ⅳ期vs.Ⅰ-Ⅱ期,p＜0.05）。肺癌中存在Dvl各亚型的表达,Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3阳性率分别为36.3%（41/113）、36.3%（41/113）和41.6%（47/113）,它们在腺癌中的表达均高于鳞癌（p＜0.01）并与肺癌的低分化有关（p＜0.05）。Ⅲ-Ⅳ期肺癌中Dvl-1和Dvl-2的表达明显高于Ⅰ-Ⅱ期肺癌（p＜0.05）。在39例配对肺癌资料中,总Dvl、Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3在淋巴结转移灶中的阳性表达率分别87.2%（34/39）、69.2%（27/39）、51.3%（20/39）和69.2%（27/39）,在原发灶中的阳性表达率分别为64.1%（25/39）、48.7%（19/39）、35.9%（14/39）和48.7%（19/39）。总Dvl、Dvl-1和Dvl-3在淋巴结中的阳性表达率明显高于配对原发灶组织（p＜0.05）。Dvl-2在转移灶和原发灶表达差异无统计学意义（p＞0.05）。配对资料中,原发灶总Dvl和Dvl-2的表达与β-catenin表达相关（p＜0.05）,而Dvl-1和Dvl-3的表达与β-catenin表达无关（p＞0.05）;转移灶中总Dvl和Dvl-1的表达与β-catenin表达相关（p＜0.05）,而Dvl-2和Dvl-3的表达与β-catenin表达无关（p＞0.05）。在细胞系实验中,转染Dvl-1后A549和QG56细胞出现了明显的Dvl-1蛋白核定位,但转染Dvl-3的A549和QG56细胞却无明显Dvl-3蛋白核定位。过表达Dvl-1或Dvl-3对两种肺癌细胞系的β-catenin mRNA水平均无明显影响（p＞0.05）,但过表达Dvl-1能上调A549和QG56细胞β-catenin蛋白水平（p＜0.05）,而过表达Dvl-3不影响QG56细胞的β-catenin蛋白水平（p＞0.05）,却下调了A549细胞的β-catenin蛋白水平（p＜0.05）。在A549和QG56肺癌细胞中过表达Dvl-1或Dvl-3后,两种肺癌细胞系的侵袭能力均明显强于对照组细胞（p＜0.01）。结论1、肺鳞癌和腺癌中存在Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白的阳性表达,而分化成熟的肺支气管上皮对任何一种Dvl蛋白均呈阴性表达。肺腺癌中Dvl蛋白的阳性表达率高于鳞癌并与肺癌的低分化有关。2、Dvl-1和Dvl-2蛋白的阳性表达与肺癌的高TNM分期相关。淋巴结转移灶中Dvl-1和Dvl-3蛋白表达高于原发灶。原发灶Dvl-2与β-catenin表达相关,而转移灶中Dvl-1与β-catenin表达相关。3、过表达Dvl-1和Dvl-3均能促进肺癌细胞的侵袭。在不影响β-catenin转录水平的情况下,过表达Dvl-1能升高肺癌细胞的β-catenin蛋白水平,而过表达Dvl-3不改变甚至降低肺癌细胞的β-catenin蛋白水平。4、Dvl-1可能通过经典Wnt/β-catenin通路,而Dvl-3可能通过非经典Wnt通路或其它信号通路促进肺癌侵袭转移。