密码子优化提高重组金葡菌肠毒素O在大肠杆菌中的表达水平

论文摘要

超抗原（Superantigen, SAg）这一概念最早是由John Kappler在1989年提出,由于其具大量活化T细胞的能力。这是免疫学家对金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins, SEs）、链球菌致热外毒素（streptococcal pyrogenic exotoxins, SPEs）这一类毒素的重新定义,在此之前,相关的报道主要集中在金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒、毒性休克综合症以及链球菌致热外毒素引起猩红热、毒性休克综合症等方面。金黄色葡萄球菌肠毒素是一类由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）产生的外毒素,属于典型的超抗原。与普通抗原的作用机制不同,它可以不经抗原提呈细胞（Antigen presenting cells, APC）加工处理,以完整分子的形式与Ⅱ型组织相容性抗原（major histocompatibility complex classⅡ, MHC-Ⅱ）和T细胞受体（T-cell receptor, TCR）形成复合物,从而刺激T细胞的活化、增殖,并且大量释放细胞因子,如α-肿瘤坏死因子（TNF-a）、白细胞介素-2（ⅠL-2）、γ干扰素（IFN-y）等等,而这些细胞因子具有杀伤肿瘤细胞的能力。Merlin Bergdoll从食物中毒人群中成功分离鉴定出了肠毒素A,这也是最早被鉴别出来的肠毒素。摄入微克级别的肠毒素A就会引起经典的金葡菌食物中毒,特征为摄入后1-2小时开始上吐下泻并持续6-12小时。如今,已有20多种肠毒素血清型被鉴别出来,包括毒性休克综合症毒素-1 （TSST-1）, SEA-SEE,SEG-SEJ,以及与肠毒素结构类似但肠毒性未被证实的类肠毒素（staphylococcal enterotoxin-like toxins） SEl-K-SEl-R,SEl-U,还有近期被鉴别出来的SEl-U2和SEl-V.研究表明,肠毒素家族成员有着相近的遗传学性质和生化性质,金葡菌肠毒素基因主要由质粒、噬菌体、肠毒素基因簇（enterotoxin gene cluster, egc）以及金葡菌致病岛（Staphylococcus aureus Pathogenicity Island, SaPI）等遗传元件携带；金葡菌肠毒素成熟蛋白的分子量约为20000-30000Da之间。肠毒素家族的各成员之间存在着显著的序列多样性,其中同源性最低的为SEB和SEK,仅有21.8%相似；而SEA和SEE则有着81.7%的同源性。所有的肠毒素分子都是强力的T细胞激活剂,它们对不同的MHC-Ⅱ等位基因进行选择性作用并且与TCR形成不同的Vp区域结合复合物,这提示可能是为满足刺激不同类型的T细胞的需要从而导致了肠毒素家族成员的多样性。SEs具有良好的抗肿瘤理论基础,目前认为超抗原对肿瘤细胞的杀伤作用主要通过以下两种方式：（1）超抗原依赖的细胞毒作用（superantigen-dependent cell mediated cytotoxicity, SDCC）与超抗原抗体依赖性细胞溶解作用（superantigen antibody dependent cell-mediated cytolysis, SADCC）:MHC-II-SE-TCR复合体分子形成后同时激活大量CD8+T细胞以及CD4+T细胞,从而对表达MHC-Ⅱ分子的肿瘤细胞产生强烈的杀伤作用（SDCC）.此外,对表达MHC-Ⅱ类分子水平低下的肿瘤细胞而言,将针对其表面抗原的抗体与SEs结合,可再刺激机体T细胞从而达到对该肿瘤细胞杀伤的目的（SADCC）.（2）细胞因子参与的杀伤作用：激活后的CD+4 T细胞可分泌出多种细胞因子,对肿瘤细胞产生直接或间接的杀伤作用,这些细胞因子包括IFN-β、TNF-α、IL-1α、ⅠL-1β、ⅠL-2、ⅠL-6和ⅠL-12等。前人对金葡菌肠毒素的研究主要集中在经典肠毒素SEA-SEE上,而对其他肠毒素研究相对较少。肠毒素O（SEO）属于类肠毒素,它的基因由egc携带,成熟蛋白分子量大约为26700Da,同家族成员之间,其氨基酸序列与SEM的同源性最低,为23.7%,与SEN的同源性最高,为43.2%,目前尚未有关于其结晶结构的报道。本实验室已经成功克隆表达重组金葡菌肠毒素O（recombinant Staphylococcal enterotoxin O, rSEO）,在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长实验中,rSEO蛋白显示了典型的超抗原活性,该研究还证明了rSEO与我国自主研发的金葡液制剂中的有效成份SEC的超抗原活性相当,提示其潜在的药用价值。但值得一提的是在同样表达体系下,rSEO仅有较低的表达水平,约占细菌总蛋白的10%不到,使得后续的工作难以展开。因此本课题旨在保证蛋白质生物学活性的前提下通过选择优化密码子并选择合适的表达体系来提高其表达水平。为实现上述目标,本研究设计方案如下：通过PCR方法扩增得到带his标签的肠毒素O成熟蛋白质基因,将其克隆至pET28a质粒；以pET-28a-SEO-his为模板,通过PCR方法对15个稀有密码子进行突变,将突变前后的重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）后进行蛋白表达与表达量比较。通过亲和层析,阴离子层析,超滤对重组融合蛋白进行纯化,并通过蛋白质免疫印迹鉴定重组融合蛋白。最后,运用MTT法测定了重组蛋白对小鼠淋巴细胞的增殖作用。1重组pET-28a-SEO-his表达质粒的构建根据SEO基因序列设计上下游引物,上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位点,下游引物5’端引入his-tag、Xho I酶切位点和终止密码子ATT。以实验室保存的PGEX-4T-1-SEO为模板,进行PCR扩增反应。XhoⅠ/EcoR I双酶切处理PCR产物与pET-28a质粒,连接产物转化大肠杆菌DH5α后测序。2. Quick Change方法对SEO-his密码子优化根据在线分析软件分析SEO序列：SEO基因包含编码精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸的15个丰度较低的稀有密码子,密码子适应指数为0.68,平均GC含量为26.69%。设计10对引物涵盖上述15个稀有密码子位点：#1:ata→att （21）;#2:ata→att （87）、cga→cgc（96）、cga→cgc （102）;#3: gga→ggc（183）、ata→att（186）;#4:cta→ctg（249）、gga→ggc（252）;#5:ggg→ggc （336）;#6:aga→cgc （478,480）;#7:aga→cgc （514,516）;#8:gga→ggc （609）; #9:ata→att （657）;#10:ata→att （381）、gga→ggc （384）。以pET28a-SEO-his为原始模板,PCR获得产物经过DpnⅠ消化后转化大肠杆菌DH5α感受态并通过Kan抗性筛选阳性克隆,以测序正确质粒为模板和对应的引物依次进行剩余的PCR,突变后质粒依次编号为#1～#10。3.重组菌的诱导表达及目标蛋白的可溶性分析将携有pET28a-SEO-his表达质粒的大肠杆菌BL21（DE3）在2×YT培养基中37℃培养4h,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,在28℃下诱导6h后收获菌体。超声破菌后取上清及沉淀进行SDS-PAGE,发现目的蛋白基本以可溶形式存在。4.密码子优化前后的蛋白表达水平分析比较将pET28a-SEO-his以及突变质粒#1～#10转化入大肠杆菌BL21（DE3）,挑取阳性菌落接种至2×YT培养基中,37℃培养4h,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,在28℃下诱导6h后收获菌体,全菌体进行SDS-PAGE分析,目的蛋白表达量从突变前的7.49%上升至19.8%。5.融合蛋白的纯化将高压超声破菌处理后的菌液用0.22μm微孔滤膜过滤,滤液经Ni2+ NTAhis-bind resin进行亲和层析,Elute Buffer洗脱下的溶液进行SDS-PAGE分析。将脱盐后产物进行阴离子层析除去20kD杂蛋白,再次脱盐后通过分子截留量为50kD半透膜除去70kD杂蛋白后进行SDS-PAGE分析,电泳结果显示获得的SEO-his有较高纯度,可进行后续实验。6融合蛋白的免疫印迹分析通过Western bolt对融合蛋白进行分析,一抗为抗his-tag鼠单抗,二抗为HRP标记的山羊抗小鼠抗体,阳性对照为SEC2-his,阴性对照为HSA-PTH（为实验室制备的融合蛋白,不能被his-tag鼠单抗识别）。结果显示,融合蛋白SEO-his能被抗his-tag鼠单抗所识别。7重组SEO的生物学活性采用经典的MTT法,以小鼠脾淋巴细胞为靶细胞,对获得的重组SEO的活性进行检测。结果表明重组SEO在10ng/mL浓度时即可显著地刺激脾淋巴细胞的增殖,具备天然肠毒素的生物学活性。综上所述,本研究成功获得pET28a-SEO-his质粒以及其10株突变质粒。将其转化大肠杆菌BL21（DE3）后对目的蛋白进行可溶性表达,结果显示,重组肠毒素O的表达量（占菌体总蛋白）从密码子优化前的7.49%提高到优化后的19.8%。此外,本研究对重组蛋白进行了纯化,最终得到了纯度90%以上的重组蛋白。蛋白质免疫印迹鉴定其对抗his-tag抗体具有很好的特异性。小鼠淋巴细胞增殖试验表明,经过密码子优化后的重组肠毒素O （SEO-his）与rSEO同样具有的刺激淋巴细胞增殖作用,且在lOng/ml的浓度下,便能显著的刺激淋巴细胞增殖。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 1. 前言
• 2. 实验材料与试剂
• 3. 实验方法
• 4. 实验结果
• 5. 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历