用SSH方法筛选Cbfal基因的靶基因

论文摘要

骨骼的形成和发育是与许多因素相关的复杂过程,转录因子是影响骨生长非常重要的因素。目前已知与成骨细胞分化相关的转录因子有两个,即Cbfa1 （Core Binding Factor alpha 1）和Osx（Osterix）。Cbfa1于1997年被证明是控制骨形成的关键因子,它不仅控制骨的形成和生长,还可以影响软骨组织成熟,同时它可能也与破骨细胞分化及血管侵入有关。适量的表达Cbfa1可以促进成骨细胞的早期分化,而过量表达的Cbfa1则会抑制成骨细胞的成熟。2002年Kazuhisa Nakashima 等用抑制性消减杂交 （Suppression Subtractive Hybridization, SSH）的方法分离出转录因子Osx。Cbfa1和Osx基因分别作用于成骨细胞分化的不同时期。Cbfa1能使间充质干细胞向着成骨细胞方向分化,也可以使已分化的细胞向着成骨细胞方向逆分化,而Osx在前成骨细胞向成骨细胞分化过程中起重要作用。 本论文直接目的是分别在间充质干细胞和已分化的骨细胞中分离出受 Cbfa1 调控的靶基因,从而比较 Cbfa1 在促进处于发育不同阶段的细胞向成骨细胞方向分化过程中所作用的靶基因的异同。长远目标在于找到其他的与骨骼细胞分化相关的转录因子。本文以间充质干细胞（C3H10T1/2）和具有早期的骨细胞特征细胞 MLO-Y4（Murine Long Bone Osteocyte-Y4）为研究对象,过量表达 Cbfa1 后,用 SSH 的方法筛选受 Cbfa1 调控的靶基因,成功构建了两种细胞的 Cbfa1 诱导表达基因片段的文库,从文库中随机选出的阳性克隆测序,并得到相应的基因片段序列,并对两种不同细胞的测序结果进行分析比较。 本实验用 Virtual Northern Blot 的方法证明了本次实验的特异性,也直接证明了实验的正确性和可行性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 引言
• 一 文献综述
• （一） 骨骼的发育及其影响因素
• （二） 成骨细胞分化相关的转录因子的研究及进展
• （三） 分离特异表基因的方法研究以及进展
• 二 本论文的研究内容和意义
• 材料和方法
• 一 实验材料
• 1 细胞及其培养试剂
• 2 细胞转染以及RNA 制备试剂
• 3 SSH 相关试剂以及药品
• 4 主要仪器及设备
• 二 实验方法
• 1 MLO-Y4 细胞的培养
• 2 C3H10T1/2 细胞的培养
• 3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4 感受态细胞的转化及α互补筛选
• 5 转染质粒的制备
• 6 细胞的转染
• 7 RNA 的制备及电泳检测
• 8 RT－PCR
• 9 PCR- Selected subtraction（抑制性消减杂交SSH）
• 10 Virtual Northern blot
• 结果与分析
• 一 转染绿色荧光蛋白结果
• 二 转染效率检测的RT-PCR 的结果
• 三 抑制性消减杂交（SSH）的结果
• 1 PCR 法合成dscDNA
• 2 回收产物经过 RsaI 酶切后电泳结果
• 3 酶切后产物与 Adaptor 连接 PCR 检测结果
• 4 第一次 PCR 结果
• 5 第二次 PCR 结果
• 6 文库的构建
• 7 Virtual Northern Blot 结果分析
• 8 测序结果分析
• 9 在MLO-Y4细胞中Cbfa1对Osx的作用
• 讨 论
• 一 细胞转染
• 二 SSH 成功的必要条件
• 三 测序结果分析
• 四 Cbfa1 在 MLO-Y4 细胞中诱导 Osx 的表达
• 五 SSH 方法的缺欠
• 结 论
• 参考文献
• 致 谢