十字花科黑腐病菌双组分调控系统基因XC2229的鉴定

论文摘要

双组分系统是由感受信号输入的组氨酸蛋白激酶（sensor）和调节信号输出的调控蛋白（respose regulator）所组成的信号调控系统,涉及许多原核生物、真菌、黏菌和植物的各种信号转导途径。十字花科黑腐病菌,学名为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）,是一类γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌,能在世界范围侵染十字花科植物,给农业生产造成重大损失。从本实验室构建的Xcc8004菌株Tn5-gusA5插入突变体库中,获得一株致病力下降,但仍能诱导非寄主植物产生过敏反应的突变体186807。TAIL-PCR分析表明,突变体186807中Tn5-gusA5插入位点位于XC2229编码序列中。通过对XC2229的同源序列进行比对,发现XC2229的编码产物是双组分调控系统的感受蛋白（sensor）,其功能鉴定可为病原微生物双组分调控系统研究提供参考。为研究XC2229的功能,本工作构建了该基因的缺失突变体DM2229。DM2229与186807在寄主上的致病力基本一致,均低于野生型Xcc 8004。生化及表型检测结果表明,DM2229的胞外多糖（exopolysaccharides,EPS）产量降低,降解淀粉、纤维素的能力减弱,细胞运动能力减弱。用带有完整XC2229基因的pLALR6互补DM2229,互补菌株CDM2229在EPS合成、胞外酶生成、细胞运动能力等方面基本与野生型Xcc 8004基本一致,致擦指吹揭吧蚗cc 8004的95.4%。因为该基因位于鞭毛基因区,为了研究XC2229与该区域内其它鞭毛基因的调控关系,我们采用RT-PCR技术对Xcc 8004注释的与鞭毛相关基因在野生型菌株与缺失突变体DM2229的表达状况进行了比较分析。试验结果表明,在转录水平上,XC2229对fliL、fliJ和fliC可能起正调控作用;对flgA可能起负调控作用。没有发现XC2229对其它鞭毛区基因有明显的调控作用。实验结果表明,XC2229是一个与EPS合成、胞外酶生成、鞭毛生成与控制等生理生化过程相关的基因。推测该基因通过调控EPS合成、菌体鞭毛生成、胞外酶生成等致病相关因子,从而影响十字花科黑腐病菌的致病性。双组分系统至少包含两个元件,但是目前还没有找到与XC2229相配的调控蛋白（respose regulator）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 双组分调控系统
• 1.1.1 双组分调控系统简介
• 1.1.2 双组分调控系统的磷酸基团传递途径
• 1.1.3 双组分调控系统的分布
• 1.1.4 双组分调控系统调控病原菌的致病力
• 1.1.5 双组分调控系统是理想的药物候选靶标
• 1.2 十字花科黑腐病菌的简单介绍与基因组信息
• 1.2.1 十字花科黑腐病菌的简单介绍
• 1.2.2 十字花科黑腐病菌的基因组信息
• 1.3 十字花科黑腐病菌主要致病因子与致病作用
• 1.3.1 胞外多糖（EPS）
• 1.3.2 脂多糖（LPS）
• 1.3.3 胞外酶
• 1.3.4 致病效应物
• 1.4 十字花科黑腐病菌基因组注释的双组分调控系统基因
• 1.5 本工作的内容、目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 研究用的材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 抗生素和其它药剂
• 2.1.3 植物材料
• 2.1.4 细菌培养基
• 2.1.5 常用溶液与缓冲液
• 2.2 常规微生物学操作
• 2.2.1 培养条件及保存
• 2.2.2 突变体营养缺陷型检测
• 2.2.3 胞外多糖的检测
• 2.2.4 胞外蛋白酶的检测
• 2.2.5 胞外淀粉酶的检测
• 2.2.6 胞外纤维素酶的检测
• 2.2.7 细菌泳动性的检测
• 2.2.8 Xcc在培养基生长情况测定
• 2.3 分子操作技术
• 2.3.1 质粒的提取
• 2.3.2 十字花科黑腐病菌总DNA的提取
• 2.3.3 DNA片段的回收
• 2.3.4 限制性内切酶酶切
• 2.3.5 DNA连接
• 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.7 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.3.8 十字花科黑腐病基因组总RNA的提取与纯度检测
• 2.3.9 细菌的转化与接合实验
• 2.3.10 Xcc 8004基因组上目标基因的缺失突变体的构建与互补
• 2.4 植株试验
• 2.4.1 植株的致病性试验
• 2.4.2 过敏反应
• 2.5 生物信息学分析方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 XC2229的生物信息学分析
• 3.1.1 XC2229基因的基本特征
• 3.1.2 XC2229编码产物的结构域分析
• 3.1.3 XC2229编码产物的跨膜结构分析
• 3.1.4 XC2229编码产物的蛋白的疏水结构分析
• 3.1.5 XC2229基因推测编码蛋白的同源性比较
• 3.2 XC2229的Tn5-gusA5突变体筛选
• 3.3 XC2229的缺失突变体的构建
• 3.3.1 XC2229左右臂和Gm抗性基因的PCR扩增
• 3.3.2 连接与电转化
• 3.3.3 三亲接合与突变体的筛选及验证
• 3.4 XC2229突变体的功能互补
• 3.4.1 XC2229互补基因的扩增
• 3.4.2 将XC2229全基因克隆到载体pLAFR6上
• 3.4.3 三亲本接合子的获得
• 3.5 XC2229缺失突变体的基本培养特性
• 3.5.1 DM2229不是营养缺陷型突变体
• 3.5.2 缺失突变体DM2229在营养胁迫下生长速率下降
• 3.6 XC2229与Xcc 8004的致病性相关
• 3.6.1 DM2229在寄主上致病力降低
• 3.6.2 DM2229能诱导非寄主植物过敏反应
• 3.7 XC2229与Xcc的主要致病因子的关系
• 3.7.1 胞外蛋白酶活性检测
• 3.7.2 胞外纤维素酶活性检测
• 3.7.3 胞外淀粉酶活性检测
• 3.7.4 胞外多糖检测
• 3.7.5 XC2229与Xcc 8004游动性的关系
• 3.7.6 XC2229与Xcc 8004生物聚膜的关系
• 3.8 XC2229对相关基因的转录水平调控（RT-PCR方法）
• 3.8.1 总RNA的提取
• 3.8.2 反转录PCR
• 3.8.3 XC2229基因调控鞭毛合成及控制相关基因的表达
• 第四章 讨论
• 4.1 XC2229是一个单独存在的双组分系统的感受蛋白基因
• 4.2 XC2229基因的突变体不是营养缺陷型
• 4.3 XC2229基因与EPS、胞外酶合成、细胞运动等有关
• 4.4 XC2229与部分编码鞭毛蛋白基因的表达调控关系
• 4.5 XC2229基因的突变影响十字花科黑腐病菌Xcc 8004侵染植物的能力
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况