四川姜瘟病菌的RAPD分析

论文摘要

姜在我国栽种历史悠久,是一种重要的调味品,也是一种重要的农产品,具有很大的经济价值,在农民增收和人民生活中具有极其重要的作用和地位。近年来,姜瘟病的发生日益严重,极大地影响了生姜的产量和品质。在四川雅安、乐山、眉山、温江、简阳、宜宾等六地调查姜瘟病的发生情况,发现姜瘟引起的生姜产量损失一般在10-30%左右,严重的会导致绝产绝收。发病后,整个植株开始变黄,逐渐萎焉,最后倒伏。 从发病生姜上分离得到了致病菌,经鉴定为茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）。对其进行了细菌学性状的研究表明:NA,PDA,TTC培养基均比较适合该菌的生长;不同的温度、pH值对其生长有明显的影响,最适生长温度为32℃,超过40℃不能生长;最适pH为7.5。青枯菌为G-菌,大小0.5-1×1.5-4μm。在生理生化性状方面,鉴定了姜瘟病菌利用乳糖、纤维二糖和明胶等碳水化合物以及大分子化合物的情况。 试验测定了姜瘟病菌在番茄、辣椒、茄子以及生姜上的致病性,结果表明:不同的菌株存在明显的生理分化,且致病性有所不同,从生姜上分离的青枯菌对生姜致病,对其他茄科植物的致病力较弱。还鉴定了四川姜瘟病的生物型,发现其存在Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型等四个生物型。其中以Ⅲ型和Ⅰ型为主要的生物型,分别占总样的58.1%和27.3%,生物型Ⅰ在姜上首次报道。 在对姜瘟病菌进行DNA水平上的遗传多样性分析时,我们使用了改进的氯化苄法提取供试菌株的DNA,样品共32个。经过不同组分浓度的筛选,最终建立了适用于青枯菌RAPD的最佳反应体系:反应体系25μl,10×buffer2.5μl,随机引物0.3μmol/l,模板DNA50ng,dNTP浓度50μmol/l,Mg2+浓度2.5μmol/l,taqDNA聚合酶2.0U。反应程序:94℃预变性3min;94℃lmin,36℃lmin,72℃2min,40个循环;72℃延伸10min,4℃保存。并127个RAPD通用引物中筛选出11条引物,对32个菌株的DNA进行了PCR扩增,应用凝胶图谱分析软件分析了32个菌株的DNA指纹特征,并用ntsys软件进行了聚类分析。RAPD结果表明,共扩增出619条条带,其中580条为多态性带,占93.7%,扩增片段多在0.3-3.5kb之间。其中,引物OPD07、OPD20、OPI06、OPI14、OPK19、OPQ18的扩增多态性较高,达到95%以上。通过聚类,将32个菌株聚为4大类,Ⅰ类主要来自温江、宜宾以及部分2004在雅安分离的菌株;第

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 青枯菌概述
• 1.2 RAPD概述
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 姜瘟病原的采集、分离、纯化和保存
• 2.1.1 病原菌的采集
• 2.1.2 病原菌的分离、纯化和保存
• 2.2 病原菌的鉴定
• 2.2.1 形态学鉴定
• 2.2.2 生理生化性状鉴定
• 2.3 生物学特性研究
• 2.3.1 病原菌的生长与温度和光照的的关系
• 2.3.2 病原菌的生长与pH的关系
• 2.3.3 病原菌菌的生物型测定
• 2.3.4 病原菌的致病性测定
• 2.4 病原菌的RAPD分析
• 2.4.1 供试菌株
• 2.4.2 试验主要器材
• 2.4.3 菌体收集
• 2.4.4 DNA提取
• 2.4.5 RAPD体系的建立与优化
• 2.4.6 引物筛选
• 2.4.7 凝胶电泳检测
• 2.4.8 凝胶成像
• 2.4.9 图谱聚类分析
• 3 结果与分析
• 3.1 姜瘟病原的采集，分离，纯化和保存
• 3.2 病原菌的鉴定
• 3.2.1 形态学鉴定
• 3.2.2 生理生化性状鉴定
• 3.3 生物学特性研究
• 3.4 病原菌的RAPD分析
• 3.4.1 DNA提取
• 3.4.2 引物筛选
• 3.4.3 RAPD体系的建立与优化
• 3.4.4 PCR扩增结果
• 3.4.5 图谱聚类分析
• 4 讨论
• 4.1 姜瘟病菌的生物型
• 4.2 姜瘟病菌的遗传多样性
• 4.3 姜瘟病菌DNA的提取
• 4.4 RAPD的优化及影响因素
• 4.5 RAPD在遗传多样性研究中的作用
• 4.6 RAPD存植物抗病性遗传育种中的应用
• 参考文献
• 附表
• 附图
• 致谢
• 附：攻读硕士期间发表的论文