木糖还原酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

论文摘要

木糖是植物木质纤维素的重要组成部分,木糖的发酵在生物质转化燃料乙醇中非常重要。传统乙醇生产菌株酿酒酵母只能利用葡萄糖,而不能利用木糖发酵,但能发酵其异构体木酮糖,可通过基因工程的方法将代谢木糖的关键基因转入酿酒酵母,对其进行改造以获得能利用木质纤维素水解液中的多种组分又能稳定高效产乙醇的基因工程菌。因此本研究主要目的是从发酵木糖的高效菌株树干毕赤酵母中获得发酵乙醇的第一个关键基因木糖还原酶基因,并将其转化酿酒酵母,为后续发酵木糖产乙醇基因工程菌的构建奠定基础。本研究以树干毕赤酵母（Pichia stipitis） CBS6054为基因供体菌,依据其在NCBI中公布的木糖还原酶基因序列设计特异引物,采用PCR的方法克隆到木糖还原酶基因序列,测序结果表明所得序列无碱基突变。将基因克隆到带有强启动子GPD的穿梭表达载体p424GPD中,并将载体p424GPD-xyl1转化大肠杆菌,通过超声破碎方法提取大肠杆菌总蛋白,SDS-PAGE电泳分析总蛋白,测定木糖还原酶酶活,验证载体构建成功,表达载体的成功构建为后续利用木糖发酵重组酿酒酵母的构建奠定基础。将构建好的表达载体线性化处理后转化酿酒酵母单倍体,通过营养缺陷型和PCR检测进行筛选。将筛选出的阳性重组子进行培养,测定酶活,重组1916和1917的酶活测定结果在0.1-0.3U/mg左右。将酶活最高的重组单倍体酵母1916-8与1917-1进行结合,根据子囊孢子染色筛选二倍体,测定二倍体酶活,酶活结果在0.1U/mg左右,相比较单倍体酿酒酵母木糖还原酶基因的表达量,二倍体酿酒酵母酶活较低,没有达到预理想结果。将表达载体导入酵母中表达,酵母经过若干代繁殖后,质粒容易丢失,所以构建了酵母整合载体。将表达载体上的调控元件和木糖还原酶基因通过酶切酶连方法连接到整合载体上,其后通过将整合载体将木糖还原酶基因整合到酵母染色体上,使之成为酵母染色体DNA的一部分,增强其遗传稳定性,从而使其在酿酒酵母中高效稳定的表达,为构建高效稳定发酵木糖的酵母基因工程菌构建奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪言
• 前言
• 1.1 自然界中利用木糖的微生物及木糖代谢途经
• 1.1.1 利用木糖的微生物
• 1.1.2 自然界中木糖代谢途经
• 1.1.2.1 木糖还原酶
• 1.1.2.2 木糖醇脱氢酶
• 1.1.2.3 木酮糖激酶
• 1.2 代谢木糖酵母工程菌的研究进展
• 1.2.1 细菌木糖异构酶基因在酿酒酵母中的表达
• 1.2.2 树干毕赤酵母的木糖代谢基因在酿酒酵母中的表达
• 1.3 酿酒酵母的转化体系
• 1.3.1 用于基因表达的宿主菌选择
• 1.3.2 选择标记
• 1.3.3 载体的选择
• 1.3.4 转化方法
• 1.4 本研究的目的与意义
• 1.5 研究内容
• 第二章 树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 前言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 工具酶及主要试剂
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 主要溶液和培养基配制方法
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 树干毕赤酵母基因组的提取及DNA纯度浓度的检测
• 2.2.2 目的基因的扩增
• 2.2.3 载体pGMT-xyl1的构建与转化
• 2.2.4 p424GPD-xyl1表达载体的构建
• 2.2.5 表达产物的验证
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总DNA提取
• 2.3.2 PCR结果
• 2.3.3 载体pGMT-xyl1的筛选与目的基因的测序分析
• 2.3.4 p424GPD-xyl1表达载体的构建
• 2.3.5 表达产物的验证
• 2.4 讨论
• 第三章 木糖还原酶基因在酿酒酵母中的表达
• 前言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 工具酶
• 3.1.3 主要实验仪器
• 3.1.4 培养基和部分溶液配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 转化单倍体酿酒酵母
• 3.2.2 单倍体酿酒酵母酶活的检测
• 3.2.3 重组酵母的验证
• 3.2.4 单倍体酿酒酵母的接合及二倍体的筛选
• 3.2.5 二倍体酿酒酵母酶活的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 重组单倍体酵母的筛选及酶活测定
• 3.3.2 重组单倍体酵母PCR验证
• 3.3.3 单倍体酿酒酵母的杂接合及二倍体的筛选
• 3.3.4 二倍体酵母的木糖还原酶酶活的测定
• 3.4 讨论
• 第四章 整合载体的构建
• 前言
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 工具酶
• 4.1.3 主要实验仪器
• 4.1.4 培养基和部分溶液配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 重组载体p424GPD-xyl1和整合载体YIP5的提取
• 4.2.2 目的片段GPD-xyl1-CYC1的扩增
• 4.2.3 整合载体YIP5-xyl1的构建
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 目的片段GPD-xyl1-CYC1的扩增结果
• 4.3.2 目的片段GPD-xyl1-CYC1及整合载体YIP5分步双酶切结果
• 4.3.3 整合载体YIP5-xyl1的筛选与目的基因的测序分析
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 建议
• 参考文献
• 附录A 缩略词表
• 附录B DNA序列比对结果
• 附录C PGM-T载体图谱
• 附录D P424GPD表达载体及YIP5整合载体图谱
• 附录E 攻读硕士研究生期间的科研成果
• 致谢