假蕈状芽孢杆菌B-60菌株纤溶酶的分离纯化与性质分析

论文摘要

血栓栓塞性疾病（thrombotic disease, TD）发病率、致残率、致死率皆高,已成为严重危害人类健康的疾病之一。药物溶栓是目前临床应用最广泛、最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已发展了三代,但依然存在一定的缺陷,仍有待开发安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从微生物中开发出一种新型溶栓剂。从自然界分离的一株胞外产纤溶酶的芽孢杆菌B-60菌株,通过对它的形态、生理生化特征进行研究,对其16S rDNA序列进行测定与比对,发现芽孢杆菌B-60菌株与假蕈状芽孢杆菌的形态、生理生化特征相符,与其16S rDNA序列也有高达99.38%的同源性。根据多相分类原则,认为芽孢杆菌B-60菌株为假蕈状芽孢杆菌（Bacillus pseudomycoides）。采用单因子试验和正交试验对产纤溶酶的假蕈状芽孢杆菌B-60的发酵条件进行优化。产纤溶酶最佳条件为：蔗糖15 g/L,豆饼粉15 g/L, MnSO4·H2O 3.4 g/L, CaCl2 3.3 g/L, K2HPO4·3H2O 0.8 g/L, KH2PO4 0.2 g/L, MgSO4·7H2O 7.4g/L;培养温度32℃,培养基初始pH6.5～7.0,装液量250 mL的三角瓶50 mL,接种量2%～6%,发酵时间56 h左右。Ca2+、Mg2+、K+、Mn2+对酶活有促进作用,Zn2+、Fe2+对酶活有强烈抑制作用。优化后,点样10μL发酵液溶圈直径为19.5mm,溶圈面积为298 mm2。利用硫酸铵沉淀和阴离子交换色谱从假蕈状芽孢杆菌B-60菌株中分离纯化出具有纤溶活性的单体蛋白单一组分（BpFE）,并对BpFE性质进行分析。BpFE表观分子量为34 kD。它在4℃～50℃活性较稳定,50℃以上活性急剧下降；作用最适pH值为pH5～6,在pH5-10活性较稳定,在pH3.0,活性几乎丧失；金属离子Ca2+, Mg2+, Mn2+对酶活有轻微促进作用,Cu2+则强烈抑制酶活。苯甲基磺酰氟（PMSF）完全抑制它的活性。BpFE经胰蛋白酶和胃蛋白酶降解后,活性上升。N端15个氨基酸序列为VTGTN AVGTG KGVLG,比对结果表明,BpFE N端氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽杆菌和乳杆菌的bacillolysin, neutral protease, hydrolase的一部分序列同源性为100%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第1章 绪论
• 1.1 血栓的形成及溶解机制
• 1.1.1 血栓形成机制
• 1.1.2 栓溶解机制
• 1.2 溶栓药物的研究进展及前景展望
• 1.2.1 溶栓药物的来源
• 1.2.2 溶栓药物的发展历程
• 1.2.3 现有溶栓药物的主要缺陷
• 1.2.4 新型溶栓药物的开发及发展趋势
• 1.3 微生物溶栓药物研究概况
• 第2章 纤溶酶产生菌株Bacillus B-60的鉴定
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 纤溶活性测定
• 2.2.2 B-60菌株的鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 纤溶活性测定
• 2.3.2 分类鉴定
• 第3章 假蕈状芽孢杆菌B-60菌株的发酵条件优化
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌株培养方法
• 3.2.2 种子生长曲线绘制及产酶高峰
• 3.2.3 纤溶酶活性的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 B.pseudomycoides B-60菌株种子生长曲线与发酵时间
• 3.3.2 B.pseudomycoides B-60菌株发酵培养基组成的优化
• 3.3.3 发酵条件的优化
• 3.4 讨论
• 第4章 假蕈状芽孢杆菌B-60菌株的蛋白分离纯化及性质
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 B.pseudomycoides B-60菌株蛋白提取物的制备
• 4.2.2 初步鉴定B.pseudomycoides B-60菌株提取物的成分
• 4.2.3 B.pseudomycoides B-60蛋白的分离纯化
• 4.2.4 检测分离效果和目标蛋白的相对分子质量（Mr）
• 4.2.5 B.pseudomycoides B-60纤溶酶（BpFE）的N-端氨基酸序列测定
• 4.2.6 蛋白质浓度标准曲线和尿激酶活力标准曲线的制作
• 4.2.7 B.pseudomycoides B-60菌株提取物及BpFE纤溶比活力测定和比较
• 4.2.8 BpFE的最适温度和最适作用pH值
• 4.2.9 蛋白酶抑制剂对BpFE活性的影响
• 4.2.10 金属离子对BpFE活性的影响
• 4.2.11 胰蛋白酶和胃蛋白酶对BpFE的作用
• 4.3 结果
• 4.3.1 纤溶活性成分的鉴定
• 4.3.2 DEAE阴离子交换色谱
• 4.3.3 BpFE N-端序列
• 4.3.4 B.pseudomycoides B-60菌株提取物及BpFE纤溶比活力测定和比较
• 4.3.5 BpFE的温度适应性和酸碱稳定性
• 4.3.6 蛋白酶抑制剂对BpFE活性的影响
• 4.3.7 金属离子对BpFE活性的影响
• 4.3.8 胰蛋白酶和胃蛋白酶对BpFE的作用
• 4.4 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢