蝉花发酵生产免疫活性组分ISP的研究

论文摘要

蝉花（Cordyceps cicadae）是我国传统的名贵药用蕈菌（medicinal mushroom）。因其与冬虫夏草一样同属虫菌复合体,且含有相近的化学成分,所以医家常作冬虫夏草的代用品,具有极高的药用价值。现代医学研究表明,ISP是其重要的生物活性组分,具有显著的免疫抑制作用,其中主要成分为多球壳菌素（ISP-1）。无论在细胞生长周期,对环境的污染还是产物的积累方面,发酵培养蝉花生产ISP都具有其独特的优越性,具有重要的应用价值。本论文研究了大孔吸附树脂分离纯化蝉花ISP的洗脱工艺,并建立起一种新的快捷有效测定ISP的方法。在此基础上,为获得高产ISP的最佳培养条件,考察了培养基碳源和氮源对蝉花细胞生长和ISP生产的影响,并且通过对碳源和氮源的优化,显著提高了蝉花发酵生产ISP的产量。（1）研究了大孔吸附树脂分离纯化蝉花ISP的洗脱工艺,探讨了乙醇解吸浓度对分离纯化效果的影响。采用薄层色谱对ISP的分离纯化进行定性的跟踪检测,并使用HPLC-MS联用确证了我们的结论。建立起蝉花ISP的分离纯化工艺为:选用NKA型非极性大孔吸附树脂对其进行分离纯化,上柱液以1BV/h的速度流过树脂,待吸附平衡后,用4BV的水以2BV/h的速度淋洗树脂,再用4BV的50%乙醇以2BV/h的速度淋洗树脂,流出液弃之,然后用95%的乙醇溶液以1BV/h的流速进行洗脱,收集4BV的洗脱液,60℃减压浓缩至干,甲醇溶解,即得ISP类次生代谢产物甲醇溶液。将ISP甲醇溶液通过正丁醇萃取,可显著提高ISP的含量,达到蝉花免疫抑制有效部位的标准。（2）使用茚三酮比色法测定蝉花发酵液中的ISP的含量,探讨了此显色反应的影响因素、反应条件,通过线性和范围、精密度、稳定性和准确度等指标评价该方法,并通过与薄层色谱结果之比较印证该方法的准确性,建立起一种快捷有效测定蝉花免疫活性组分ISP的方法。（3）通过摇瓶培养,研究了蝉花细胞生长和ISP产物积累的动态变化过程。实验结果显示,蝉花细胞生长和ISP产量并不同步,分别在第8天和第12天达到最大值。为获得更高产的ISP产量,对发酵培养蝉花生产ISP的培养基的碳源和氮源进行了优化,实验结果表明,蔗糖和酵母粉最有利于ISP合成。在优化的培养基中,ISP的产量显著提高,达到32.25mg/L,比对照提高了83.56%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 蕈菌
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 蕈菌发酵培养
• 1.2 蝉花的研究概况
• 1.2.1 蝉花背景资料简介
• 1.2.2 历史文献中关于蝉花的记载
• 1.2.3 蝉花的化学成分
• 1.2.4 蝉花的药理作用
• 1.3 免疫抑制剂简介及其发展应用
• 1.4 ISP 的研究概况
• 1.5 课题的提出与研究意义
• 1.6 课题研究内容与技术路线
• 1.6.1 ISP 分离纯化工艺研究
• 1.6.2 ISP 含量测定的研究
• 1.6.3 培养基碳源、氮源的优化
• 1.7 课题的创新点
• 2 大孔吸附树脂分离纯化蝉花中ISP
• 2.1 大孔吸附树脂技术简介
• 2.1.1 大孔吸附树脂的特性及原理
• 2.1.2 分类及性能
• 2.1.3 大孔吸附树脂的预处理
• 2.1.4 解吸溶媒（洗脱剂）的选择
• 2.1.5 洗脱起始点和终点判断
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蝉花的深层发酵培养
• 2.3.2 上柱样品制备
• 2.3.3 树脂的选择及其处理
• 2.3.4 解吸
• 2.3.5 薄层层析
• 2.3.6 ISP 的萃取
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 确定乙醇洗脱浓度
• 2.4.2 用确定后的乙醇浓度梯度验证洗脱
• 2.4.3 ISP 的萃取
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 3 HPLC-MS 联用检测蝉花中ISP
• 3.1 仪器与试剂
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 色谱条件
• 3.2.2 质谱条件
• 3.2.3 供试品溶液的制备
• 3.2.4 对照品溶液的配制
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 HPLC 结果分析
• 3.3.2 质谱分析
• 3.4 小结
• 4 蝉花中ISP 的含量测定
• 4.1 实验原理
• 4.1.1 紫外与可见光分光光度法测定原理
• 4.1.2 茚三酮比色法测定ISP 含量原理
• 4.2 仪器与试剂
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验试剂及配制
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 样品溶液制备
• 4.3.2 比色测定
• 4.3.3 薄层检测
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 最大吸收波长的确定
• 4.4.2 反应温度和反应时间的确定
• 4.4.3 标准曲线的绘制
• 4.4.4 精密度和稳定性实验
• 4.4.5 重现性实验
• 4.4.6 回收率实验
• 4.4.7 样品测定分析
• 4.5 讨论
• 4.5.1 样品甲醇溶液稀释剂的选择
• 4.5.2 薄层层析结果分析
• 4.6 小结
• 5 液体培养蝉花生产ISP 培养基碳源、氮源的优化
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 菌种
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 蝉花的深层发酵培养
• 5.2.2 细胞生长和ISP 形成动力学
• 5.2.3 碳源种类的影响
• 5.2.4 氮源种类的影响
• 5.2.5 优化的培养基对ISP 产量影响
• 5.3 分析方法
• 5.3.1 取样
• 5.3.2 细胞量
• 5.3.3 ISP 的分离纯化及含量测定
• 5.3.4 参数的计算
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 细胞生长和ISP 形成的动力学
• 5.4.2 碳源种类的影响
• 5.4.3 氮源种类的影响
• 5.4.4 优化的培养基对ISP 产量的影响
• 5.5 小结
• 6 结论及后续工作建议
• 6.1 全文主要内容及结论
• 6.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录