根癌农杆菌介导申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变的研究

论文摘要

申克氏孢子丝菌（Sporothrix schenckii）是一种双相型病原真菌,引起人和动物的孢子丝菌病（Sporotrichosis）。本研究首次成功建立了根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌JLCC32757遗传转化体系,并探讨了影响转化效率的主要因素。该转化体系效率达600个转化子/106个分生孢子,可在短期内获得大量T-DNA（Transfer DNA）插入突变体,且这些突变体有丝分裂稳定。已获得突变菌株2130株,初步建立了小范围的申克氏孢子丝菌T-DNA标签的突变体库,并得到了一些生长、发育、代谢等表型发生改变的突变体,为揭示申克氏孢子丝菌分子机理、探讨致病机制等奠定了坚实的基础。申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变体的分子分析表明,T-DNA已插入到申克氏孢子丝菌基因组中,其中87%为T-DNA单拷贝插入,13%为T-DNA多拷贝插入,利用TAIL-PCR即可获得T-DNA插入位点的侧翼序列,表明根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌遗传转化是一种有效的插入突变策略,是进行申克氏孢子丝菌功能基因组学研究的有力工具。筛选申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变体,获得产色素缺陷菌株JLCC32757-M2013。与野生型相比,该菌株失去产色素的能力,其菌丝、分生孢子形态均发生明显改变。分子分析表明,T-DNA以单拷贝插入到申克氏孢子丝菌类泛素结合酶E2基因（SsUBCc）,破坏菌体内类泛素结合酶E2基因的正常表达,导致SsUBCc基因和色素合成相关基因在转录水平的表达量降低,菌株毒力下降。以突变株JLCC32757-M2013的SsUBCc基因为参照,PCR扩增模板DNA结果表明,50ng/μl模板DNA稀释1600倍时,仍能获得清晰的PCR扩增产物,含有400个突变体的DNA池的模板核酸浓度足以保证每个突变体PCR扩增的需要。由此以每100个突变体为单位,构建了21个突变体池和DNA池,既保证实验的可靠性又方便从突变体库中筛选靶基因突变的菌株,为充分利用T-DNA插入突变体库进行申克氏孢子丝菌反向遗传学研究提供技术支持。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 申克氏孢子丝菌和申克氏孢子丝菌病
• 1.1.1 申克氏孢子丝菌概述
• 1.1.2 孢子丝菌病流行趋势
• 1.1.3 申克氏孢子丝菌细胞壁的生物学特征
• 1.2 黑色素是双相型病原真菌的重要致病因子
• 1.2.1 双相型病原真菌黑色素的特性
• 1.2.2 黑色素增强双相型病原真菌对吞噬细胞的抗性
• 1.2.3 黑色素增强双相型病原真菌对环境胁迫的抗性
• 1.3 蛋白泛素化系统及其应用
• 1.3.1 蛋白磷酸化药物研究现状
• 1.3.2 泛素化比磷酸化更复杂
• 1.3.3 泛素化和磷酸化调控机制比较
• 1.4 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究进展
• 1.4.1 丝状真菌转化方法研究进展
• 1.4.2 农杆菌介导的丝状真菌遗传转化研究进展
• 1.4.3 根癌农杆菌用于丝状真菌功能基因组学研究进展
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 技术路线图
• 第2章 根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌遗传转化体系的建立
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 申克氏孢子丝菌对潮霉素的敏感性
• 2.2.2 申克氏孢子丝菌分生孢子的制备
• 2.2.3 农杆菌细胞的制备
• 2.2.4 农杆菌与申克氏孢子丝菌共培养
• 2.2.5 筛选转化子
• 2.2.6 检测转化子的遗传稳定性
• 2.3 结果
• 2.3.1 申克氏孢子丝菌对潮霉素的敏感性
• 2.3.2 农杆菌预培养过程中添加AS 对申克氏孢子丝菌转化的影响
• 2.3.3 共培养时间对转化效率的影响
• 2.3.4 不同农杆菌菌株对转化效率的影响
• 2.3.5 表型改变突变体的筛选
• 2.3.6 转化子遗传稳定性
• 2.4 讨论
• 2.4.1 真菌转化受体
• 2.4.2 根癌农杆菌预培养过程中添加乙酰丁香酮
• 2.4.3 根癌农杆菌菌株
• 2.4.4 共培养条件
• 2.5 本章小结
• 第3章 申克氏孢子丝菌T-DNA 插入突变体的分子分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 引物
• 3.1.4 试剂盒和酶
• 3.1.5 仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 申克氏孢子丝菌基因组DNA 的提取
• 3.2.2 PCR 检测T-DNA 插入突变体
• 3.2.3 Southern blotting 检测突变体T-DNA 插入拷贝数
• 3.2.4 TAIL-PCR 分离突变体T-DNA 侧翼序列
• 3.2.5 TAIL-PCR 产物测序
• 3.3 结果
• 3.3.1 T-DNA 插入突变株PCR 检测
• 3.3.2 Southern blotting 检测突变体T-DNA 插入拷贝数
• 3.3.3 TAIL-PCR 扩增T-DNA 插入突变株侧翼序列
• 3.3.4 PCR 扩增申克氏孢子丝菌ATMT 转化子完整T-DNA
• 3.4 讨论
• 3.4.1 转化子中T-DNA 插入的拷贝数
• 3.4.2 T-DNA 插入位点侧翼序列的扩增
• 3.4.3 左臂或右臂丢失现象
• 3.5 本章小结
• 第4章 申克氏孢子丝菌色素缺陷突变株JLCC32757-M2013 分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 试剂和引物
• 4.1.4 仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 突变株JLCC32757-M2013 的形态观察
• 4.2.2 T-DNA 插入突变株JLCC32757-M2013 分子分析
• 4.2.3 实时荧光定量PCR 分析SsUBCc 基因和色素合成相关基因的表达
• 4.2.4 突变株JLCC32757-M2013 致病力分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 突变株JLCC32757-M2013 的形态观察
• 4.3.2 T-DNA 插入突变株JLCC32757-M2013 分子分析
• 4.3.3 Real-time PCR 分析SsUBCc 基因和色素合成相关基因的表达
• 4.3.4 突变株JLCC32757-M2013 致病力分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 病原真菌黑色素与致病性
• 4.4.2 黑色素生物合成抑制剂的应用
• 4.4.3 泛素化与色素合成
• 4.5 本章小结
• 第5章 高通量筛选T-DNA 插入突变体的反向遗传学方法的建立
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 试剂和引物
• 5.1.3 仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 确定PCR 检测所需核酸DNA 含量的最低浓度
• 5.2.2 构建申克氏孢子丝菌T-DNA 插入突变体池和DNA 池
• 5.3 结果
• 5.3.1 PCR 检测所需核酸DNA 的最低极限
• 5.3.2 申克氏孢子丝菌T-DNA 插入突变体池和DNA 池
• 5.4 讨论
• 5.4.1 突变体库将在后基因组时代发挥重要作用
• 5.4.2 突变体池的容量
• 5.5 本章小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢