多不饱和脂肪酸DHA对前列腺癌细胞LNCaP的作用研究

论文摘要

目的前列腺癌（prostatic carcinoma,prostatic cancer,PCa）是一种老年男性常见病,其发病率在美国居男性恶性肿瘤之首,是男性死亡第二大原因。在我国,PCa的发病率逐年升高,它是一种雄激素依赖的恶性肿瘤。有研究表明长链ω-3多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）例如 DHA（二十二碳六烯酸,docosahexaenoic acid）、EPA（二十碳五烯酸,eicosapentaenoic acid）能够抑制前列腺癌细胞的生长,但尚不明确具体的分子机制。而雄激素在前列腺的增殖,分化,修复和功能方面至关重要。雄激素水平的高低在前列腺癌的发生发展中起重要作用。雄激素受体（androgen receptor,AR）是雄激素发挥功能的重要媒介,除其具有的生理功能,AR在前列腺癌的形成中亦发挥重要作用。本论文通过探讨在LNCaP细胞中DHA是否能抑制AR的功能,以研究DHA抑制LNCaP细胞生长的分子生物学机制,为前列腺癌患者临床应用多不饱和脂肪酸DHA预防和治疗疾病提供依据。方法（1）采用MTT法观察多不饱和脂肪酸DHA对前列腺癌LNCaP的细胞毒性作用。（2）通过实时荧光定量PCR和Western Blot测定中等剂量DHA（30μmol/L）对人前列腺癌细胞LNCaP AR mRNA水平和蛋白水平的影响。（3）应用Western Blot法,在加入CHX抑制蛋白的翻译过程之后,探讨高剂量DHA（50μmol/L）对前列腺癌细胞LNCaP AR表达下调的分子机制。结果（1）细胞毒性试验表明,当DHA浓度为5μmol/L时,开始对LNCaP细胞生长产生一定的抑制作用。且在一定浓度范围内,DHA对该细胞增殖的抑制作用随浓度的增加而增强。但是当DHA浓度达到40μmol/L时,DHA对该细胞增殖的抑制作用突然减弱,当DHA浓度达到50μnol/L时,DHA对该细胞增殖的抑制作用达到最强。（2）通过实时荧光定量PCR技术测定中等剂量DHA（30μmol/L）对人前列腺癌细胞LNCaP AR mRNA水平的影响,结果表明:DHA确实能够下调LNCaP细胞AR mRNA水平。与对照组相比,经30μmol/L的DHA处理后,LNCaP细胞株ARmRNA的含量减少了近44%,且其差异有统计学意义。（3）通过Western Blot技术测定中等剂量DHA（3μmol/L）对人前列腺癌细胞LNCaP蛋白水平的影响,结果表明:DHA确实能够下调LNCaP细胞AR蛋白表达。与对照组相比,经30μmol/L的DHA处理后,LNCaP细胞株AR蛋白的表达量明显减少。（4）应用Western Blot法,在加入CHX抑制蛋白的翻译过程之后,研究高剂量DHA（50μmol/L）对前列腺癌细胞LNCaP AR表达下调的分子机制。结果表明:加入DHA处理10h后已经可以引起AR蛋白表达量减少,但DHA引起AR蛋白表达量的下调无明显的时间依赖性。且加入CHX后48h后CHX抑制新蛋白合成的作用显著,AR的蛋白量降解了 45%左右,进而说明DHA引起AR表达量的下调与蛋白质的降解相比前者起主要作用。并且,DHA是通过加速蛋白质的降解途径来引起AR的下调的。结论（1）DHA能抑制LNCaP细胞的增殖,且在一定浓度范围内,DHA对该细胞增殖的抑制作用随浓度的增加而增强。（2）以AR为研究靶点,DHA能下调AR在mRNA水平和蛋白水平上的表达,且在蛋白水平上,AR表达下调是由于DHA加速蛋白质的降解而非由于抑制蛋白质的翻译过程。但在mRNA水平上,引起AR表达下调的分子机制尚待进一步研究。（3）接下来我们还将研究AR介导DHA抑制LNCaP细胞增殖的具体信号通路以及其他多不饱和脂肪酸对前列腺癌细胞的作用机制,本课题为扩大DHA在临床预防和治疗前列腺癌提供了初步依据。（4）我们推测DHA是通过泛素-蛋白酶体途径引起蛋白质降解,详细作用途径尚需进一步研究加以证实。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、DHA对LNCaP细胞生长的影响
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 肿瘤细胞株
• 1.1.2 实验方法
• 1.1.3 统计分析
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 二、DHA对LNCaP细胞AR表达的调节
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 肿瘤细胞株
• 2.1.2 主要仪器、试剂和溶液的配制
• 2.1.3 细胞培养
• 2.1.4 细胞总RNA的提取
• 2.1.5 逆转录合成cDNA
• 2.1.6 实时荧光定量PCR
• 2.1.7 细胞总蛋白的提取
• 2.1.8 蛋白含量的测定
• 2.1.9 Western blotting
• 2.1.10 统计学方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 三、DHA在蛋白水平引起AR下调的分子机制
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 肿瘤细胞株
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 前列腺癌与脂氧合酶的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢