猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究

论文题目: 猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 贝为成

导师: 陈焕春,熊远著

关键词: 猪传染性胸膜肺炎,胸膜肺炎放线杆菌,基因,重组转移质粒,基因工程突变株,生物学特性,安全性,免疫效力

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。 目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌感染猪引起的临床症状并降低死亡率,但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变,对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说,目前采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。 与灭活疫苗和亚单位疫苗不同,自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。这样,弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。构建胸膜肺炎放线杆菌突变株的传统方法存在很多缺陷。如利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性,只适合于表型发生明显变化突变子的筛选,而不导致明显表型变化的突变株就不能够通过这些方法获得;而通过同源重组导致靶基因突变方法获得的突变株最后含有抗性标记,由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。鉴于上述背景,本研究通过使用同源重组技术和负向选择方法(counterselection strategy)构建了不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因工程突变株,随后对其生物学特性进行了研究,主要研究内容包括: 1.外膜脂蛋白(omlA)基因启动子序列验证及作为启动子启动绿色荧光蛋白(GFP)基因的功能特性研究 由于胸膜肺炎放线杆菌血清1型(S4074)外膜脂蛋白基因转录起始位点已经得到证实,本研究以APP血清1型基因组DNA为模板,采用PCR扩增157 bp omlA基因启动子序列,序列测定证实无误后以正向的方式将其连接到不带启动子的绿色荧光蛋白基因(GFP)上游,构建质粒pMSKOGFP。通过电穿孔将质粒pMSKOGFP电转化到APP,在荧光显微镜下观察转化子发荧光的情况。结果含有质粒pMSKOGFP的APP转化子能够表达GFP,表明157 bp omlA基因启动子序列能够启动GFP基因在APP中表达。 2.sacB基因在APP中表达特性研究 枯草杆菌sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,表达sacB基因的革兰氏阴性细菌在含有5%蔗糖的培养基上不能生长。为了描述sacB基因在胸膜肺炎放线杆菌的表达特性,本研究采用PCR从质粒PGS284中扩增sacB基因,将它按照omlA基因启动子序列相同的方向克隆到质粒pMSK-omlA中获得重组质粒pMSKOS。同时,将单独

论文目录:

摘要

Abstract

第1章 文献综述

1.1 猪传染性胸膜肺炎流行及其危害

1.1.1 猪传染性胸膜肺炎流行现状

1.1.2 猪传染性胸膜肺炎传播途径

1.1.3 猪传染性胸膜肺炎危害

1.2 猪传染性胸膜肺炎病原学

1.2.1 胸膜肺炎放线杆菌分类、理化性质及生长特性

1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌抗原与血清型

1.2.3 胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子致病性及免疫原性研究进展

1.2.3.1 荚膜

1.2.3.2 脂多糖

1.2.3.3 外膜蛋白

1.2.3.4 转铁结合蛋白

1.2.3.5 蛋白酶

1.2.3.6 外毒素

1.2.3.7 黏附因子

1.2.4 胸膜肺炎放线杆菌致病机理

1.3 猪传染性胸膜肺炎临床症状

1.4 猪传染性胸膜肺炎病理学特征

1.5 猪传染性胸膜肺炎诊断方法研究进展

1.5.1 病原学诊断方法

1.5.2 血清学诊断方法

1.5.2.1 补体结合试验

1.5.2.2 酶联免疫吸附试验

1.5.2.3 凝集试验

1.5.2.4 环状沉淀试验

1.5.2.5 间接血凝试验

1.5.2.6 间接荧光抗体试验

1.5.2.7 乳胶凝集试验

1.5.2.8 免疫扩散试验

1.6 猪传染性胸膜肺炎防制

1.7 胸膜肺炎放线杆菌毒素研究进展

1.7.1 毒素名称和种类

1.7.2 毒素分泌、基因结构、表达与调控及其作用

1.8 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展

1.8.1 传统疫苗

1.8.1.1 灭活疫苗

1.8.1.2 亚单位疫苗

1.8.2 猪传染性胸膜肺炎新型疫苗研究现状

1.8.2.1 ghosts疫苗

1.8.2.2 口服疫苗

1.8.2.3 弱毒疫苗

1.9 负向选择方法

1.9.1 负向选择标记在细菌遗传学和病原学研究的作用

1.9.2 负向选择标记种类

第2章 研究目的与意义

第3章 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 细菌菌株

3.1.2 载体与质粒

3.1.3 主要药品和试剂

3.1.4 主要培养基和抗生素

3.1.5 本研究中所用的寡核苷酸引物

3.1.6 缓冲液

3.1.6.1 质粒提取用缓冲液

3.1.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液

3.1.6.3 Western blot缓冲液

3.1.6.4 ELISA缓冲液

3.1.6.5 Southern blot缓冲液

3.1.7 细菌基因组DNA提取试剂

3.1.8 大肠杆菌感受态制备用试剂

3.1.9 其它缓冲液及试剂

3.1.10 实验动物

3.2 试验方法

3.2.1 细菌活化

3.2.2 细菌基因组DNA提取

3.2.3 PCR或酶切产物的回收与纯化

3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备

3.2.5 连接产物及质粒的转化

3.2.6 重组质粒快速鉴定

3.2.7 重组质粒酶切鉴定

3.2.8 质粒的小量制备

3.2.9 质粒的大量制备

3.2.10 连接产物及质粒的转化

3.2.11 胸膜肺炎放线杆菌电转化

3.2.12 负向选择

3.2.13 溶血性试验

3.2.14 生长特性试验

3.2.15 Southern-blot

3.2.16 Western-blot

3.2.17 细菌计数和半数致死量(LD_(50))

3.2.18 ApxⅡ-ELISA检测方法的建立

3.2.18.1 天然毒素ApxⅡ的提取

3.2.18.2 ApxⅡ抗原最佳包被浓度的选择

3.2.18.3 ELISA阴阳性判定标准的确定

3.2.19 全菌抗体检测

第4章 结果与分析

4.1 胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白(omlA)基因启动子序列鉴定

4.1.1 omlA启动子序列PCR扩增

4.1.2 绿色荧光蛋白(GFP)基因PCR扩增和重组质粒pSKOGFP构建

4.1.3 通过GFP基因表达对omlA基因启动子序列功能特性研究

4.2 枯草芽苞杆菌sacB基因在胸膜肺炎放线杆菌中表达特性研究

4.2.1 sacB基因的PCR扩增及中间转移质粒pSKOS的构建

4.2.2 编码果聚糖蔗糖酶sacB基因的表达特性研究

4.3 胸膜肺炎放线杆菌基因工程突变株HBC~-／GFP~+的构建

4.3.1 含缺失apxⅡCA基因的转移质粒pSK-xⅡCA~-／GSA~+的构建

4.3.1.1 胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxⅡCA基因DNA扩增与克隆

4.3.1.2 重组中间质粒pSK-XⅡCA~-／GFP~+的构建

4.3.1.3 氨苄青霉素基因的PCR扩增及中间质粒pSKOSA的构建

4.3.1.4 重组转移质粒pSK-xⅡCA~-／GSA~+的构建

4.3.2 重组转移质粒pSK-xⅡCA~-／GSA~+电转化及基因工程突变株HBC~-／GFP~+筛选

4.3.3 基因工程突变株HBC~-／GFP~+鉴定及生物学特性

4.3.3.1 PCR鉴定

4.3.3.2 Southern blot鉴定

4.3.3.3 Western blot检测

4.3.3.4 溶血性试验

4.3.3.5 生长特性试验

4.3.3.6 GFP基因的遗传稳定性试验

4.4 基因工程突变株HBC~-／GFP~+对Bab／C小鼠的安全性和免疫效力试验

4.4.1 基因工程突变株HBC~-／GFP~+对Bab／C小鼠的安全性试验

4.4.2 基因工程突变株HBC~-／GFP~+Bab／C小鼠的免疫效力试验

4.4.2.1 免疫Bab／c小鼠抗ApxⅡ的ELISA抗体检测

4.4.2.2 免疫Bab／c小鼠抗全菌的间接血凝抗体水平检测

4.4.2.3 小鼠攻毒后保护效力试验

4.5 基因工程突变株HBC~-／GFP~+对仔猪的安全性和免疫效力试验

4.5.1 仔猪的安全性试验

4.5.2 仔猪的免疫效力试验

4.5.2.1 试验分组、免疫途径和免疫剂量

4.5.2.2 免疫仔猪ApxⅡ-ELISA抗体检测

4.5.2.3 免疫仔猪间接血凝抗体检测

4.5.2.4 免疫仔猪攻毒保护效果试验

4.5.2.4.1 临床症状

4.5.2.4.2 体温变化

4.5.2.4.3 攻毒后的保护效果

4.5.2.4.4 攻毒后的肺部病变情况

第5章 讨论

5.1 负向选择方法的选择

5.2 外膜脂蛋白基因启动子序列功能和sacB基因表达特性研究

5.3 apxⅡCA基因的选择及克隆

5.4 重组转移质粒pSK-xⅡCA~-/GSA~+的构建

5.5 基因缺失疫苗株HBC~-/GFP~+的毒力

5.6 基因缺失疫苗株HBC~-/GFP~+诱导动物的免疫效力

5.7 基因缺失疫苗HBC~-/GFP~+诱导动物的免疫保护

5.7.1 仔猪的安全性试验

5.7.2 仔猪的安全性试验

第6章 结论

参考文献

缩略词(Abbreviation)

附录

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

• [1].胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构与功能分析及其突变体的研究[D]. 王春来.中国农业科学院2004

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