B型烟粉虱入侵种群对噻虫嗪抗性机理的研究

论文摘要

B型烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）biotype B是近年来传入我国的重要农业害虫。该害虫在世界范围内对多种杀虫剂（尤其新烟碱类杀虫剂）产生了抗性,难以治理。噻虫嗪是目前防治这一害虫效果最好的农药品种之一。为了延缓B型烟粉虱对噻虫嗪的抗性发展,延长噻虫嗪的田间使用寿命,本研究通过B型烟粉虱室内抗性筛选及适合度、形态学分析,系统的评估了B型烟粉虱对噻虫嗪产生抗性的风险;同时,从生化与分子生物学的水平,分析了B型烟粉虱对噻虫嗪的抗性机制。主要研究内容及结论如下:一、B型烟粉虱对噻虫嗪抗性的室内连代筛选与抗性风险评估本研究利用噻虫嗪对B型烟粉虱进行了连续36代的抗性筛选,成功获得了B型烟粉虱抗噻虫嗪室内品系（TH-R）。对种群抗性监测、抗性现实遗传力（h2）评估及抗性风险预测研究发现:1)在最初筛选的17代(T1-T17),抗性发展非常缓慢,抗性只缓慢增长至约10.0倍。第18代到第23代抗性增长加快,由第18代的12.2倍增长至第23代的20.4倍;随后抗性稳定了6代(T24-T29),维持在20倍左右。从第30代(T30)开始,抗性迅速增长,增长速度高于之前所有阶段,抗性倍数由T30的25.8倍上升至第33代(T33)的66.3倍;之后,抗性基本稳定在60倍。2)抗性现实遗传力分别为0.0909（F0-F4）,0.0877(F5-F17),0.0591(F18-F23),0.0269(F24-F29),0.1703(F30-F36),整个汰选阶段的抗性现实遗传力为0.1309。3)假设遗传力为室内筛选估算值的一半,当死亡率分别为50%-90%时,预计B型烟粉虱对噻虫嗪的抗性增长10倍,需要约3-21代,而噻虫嗪抗性为隐性单基因控制。二、噻虫嗪抗性对B型烟粉虱种群适合度的影响本研究通过构建种群生命表,比较了敏感与抗性(T33)品系B型烟粉虱一系列生长发育与繁殖特征。结果表明,与敏感品系相比,抗性T33代的卵、各龄若虫平均发育历期都显著长于敏感品系,成虫寿命显著比敏感品系短,存活率与单雌产卵量也显著下降。用种群趋势指数（I）来确定抗性品系的相对适合度发现,T33代抗性品系的适合度（0.53）下降到敏感品系的1/2。因此推断,抗性适合度的下降是生产上B型烟粉虱对噻虫嗪抗性发展缓慢的原因之一。此外,对T33代进行了形态学研究,结果表明抗性品系烟粉虱形态上发生了一定改变。与敏感品系相比,抗性品系的第一、二、三龄若虫体长显著短于敏感品系,第一、四龄的体宽也显著小于敏感品系。而两品系雌、雄成虫体长之间没有差异。三、B型烟粉虱抗噻虫嗪的生化机理分析以敏感品系和噻虫嗪抗性筛选过程中代表性世代烟粉虱（25.6倍与66.3倍）为试虫,通过增效实验,交互抗性测定、代谢解毒酶活力分析,就B型烟粉虱对噻虫嗪的抗性生化机理进行了分析。测定了敏感和抗性烟粉虱的羧酸酯酶（CarE）、谷光甘肽-S-转移酶（GST）和多功能氧化酶对硝基苯甲醚-O-脱甲基（PNOD）及7-乙氧香豆素-O-脱乙基（ECOD）活力。结果表明,在两个抗性水平下,与敏感品系相比,抗性品系PNOD活性分别升高了1.21和3.23倍,ECOD活性分别升高了1.68和2.30倍,表明多功能氧化酶活性增强是产生抗性的重要原因;羧酸酯酶只在低水平抗性时升高了2.96倍,表明其只在较低抗性水平时发挥作用;而谷光甘肽-S-转移酶与抗性形成关系不大,该结果与增效实验结果一致。交互抗性研究结果表明抗性品系对与噻虫嗪同为新烟碱的吡虫啉、啶虫眯以及烯啶虫胺均表现出交互抗性,交互抗性倍数分别为47.28、35.82及9.99倍;对阿维菌素和丁硫克百威分别表现出5.33和4.43倍的交互抗性;而对氟虫腈、溴氰菊酯、毒列蜱未表现出交互抗性,揭示了噻虫嗪抗性可能存在靶标不敏感性。四、B型与ZHJ-1型烟粉虱生物学、形态学及解毒酶活力比较通过构建种群生命表,比较了B型敏感（棉花）品系与ZHJ-1型品系烟粉虱一系列生长发育与繁殖特征。结果表明,ZHJ-1型品系的卵、各龄若虫平均发育历期都显著比B型敏感品系长,成虫寿命显著比B型敏感品系短,单雌产卵量显著比敏感品系少,存活率也显著下降。各种生物学参数分析表明B型的内禀增长率、净增殖率等都大于ZHJ-1型,表现了强劲的增殖潜力。形态学研究表明,ZHJ-1型烟粉虱一龄到三龄若虫的体长、体宽都显著长于B型,而两品系四龄若虫的体长、体宽差异不显著。比较了B型敏感（棉花）品系与ZHJ-1品系烟粉虱羧酸酯酶、谷光甘肽-S-转移酶和多功能氧化酶对硝基苯甲醚-O-脱甲基（PNOD）的活性。结果表明两生物型之间3大解毒酶活性没有差异。五、B型烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体亚基的克隆采用RT-PCR技术克隆了B型烟粉虱乙酰胆碱受体（nAChR）α亚基全长基因。克隆的烟粉虱敏感品系的nAChRα亚基包含了1935个核苷酸,其开放阅读框的（ORF）的起点是第257位核苷酸,终点是第1861位核苷酸,长度为1605bp。开放阅读框编码534个氨基酸nAChR亚基前体,它包含了nAChR家族的一些典型结构:α亚基具有的保守的两个相邻的半胱氨酸,以及4个跨膜结构域等。该基因与其它昆虫nAChRs亚基具有很高同源性,最高达79%,说明克隆的亚基是烟粉虱的乙酰胆碱受体亚基基因。该基因序列Genebank登录号为:DQ480159。B型敏感与抗性品系的α亚基全长基因蛋白经比对表明,未发现突变位点,推测由于筛选品系中抗性杂合子仍占很大比例。六、噻虫嗪对B型烟粉虱乙酰胆碱受体α亚基mRNA表达的影响利用荧光定量PCR技术（Q-PCR）对B型烟粉虱乙酰胆碱受体（nAChRs）α亚基转录水平的表达进行了定量分析。以烟粉虱β-actin为内参基因,结果显示,相对于敏感品系TH-S,抗性噻虫嗪品系TH-R的nAChRsα亚基的表达量上调,其相对表达量是敏感品系的3.6倍,但方差分析筹异不显著。原因及其意义,尚有待进一步研究验证。综上所述,本研究首次评价了B型烟粉虱对噻虫嗪的抗性风险。对抗性品系进行了适合度研究,首次发现了B型烟粉虱对噻虫嗪产生抗性后会表现一系列生长、生殖劣势。代谢抗性解毒酶活性测定与增效实验相结合,揭示了抗性主要是多功能氧化酶在起作用。交互抗性的研究揭示了噻虫嗪抗性可能存在靶标不敏感性,同时为田间抗性治理提供了一定的理论基础。成功获得了受体亚基全长基因序列,但敏感和抗性品系的全长没有差异,进一步荧光定量PCR研究结果表明噻虫嗪抗性会引起nAChRsα亚基的表达量上调,为研究B型烟粉虱乙酰胆碱受体基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 烟粉虱概况
• 1.1.1 分类、起源与分布
• 1.1.2 生物学特征与危害
• 1.1.3 生物型
• 1.2 烟粉虱抗药性发生现状
• 1.2.1 烟粉虱对传统几大类杀虫剂的抗性
• 1.2.2 烟粉虱对生长调节剂类的抗性
• 1.2.3 烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性与交互抗性
• 1.3 烟粉虱抗药性机理研究
• 1.3.1 解毒酶活力增强
• 1.3.2 靶标敏感性下降
• 1.3.3 与新烟碱类杀虫剂相关的抗性机理
• 1.4 烟粉虱抗药性综合治理
• 1.4.1 化学防治
• 1.4.2 农业防治
• 1.4.3 生物防治
• 1.5 噻虫嗪研究概况
• 1.5.1 噻虫嗪简介
• 1.5.2 噻虫嗪的防治对象
• 1.5.3 噻虫嗪对非靶标生物的毒力
• 1.6 烟碱型乙酰胆碱受体的研究进展
• 1.6.1 脊椎动物烟碱型乙酰胆碱受体
• 1.6.2 昆虫烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的研究
• 1.7 本研究的总体思路、主要内容和技术路线
• 1.7.1 总体思路与主要内容
• 1.7.2 技术路线
• 第二章 B型烟粉虱对噻虫嗪抗性的室内连代筛选与抗性风险评估
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 供试试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.1.4 抗性汰选步骤
• 2.1.5 烟粉虱对噻虫嗪的抗性监测方法-琼脂保湿浸叶法
• 2）估算'>2.1.6 现实遗传力（h²）估算
• 2.1.7 抗性风险评估
• 2.1.8 抗性遗传方式评估
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 B型烟粉虱对噻虫嗪的抗性筛选
• 2.2.2 B型烟粉虱对噻虫嗪抗性现实遗传力的测定
• 2.2.3 抗性风险评估
• 2.2.4 抗性遗传方式
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 B型烟粉虱抗性种群的适合度及形态学变化研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 供试试剂
• 3.1.3 试验仪器
• 3.1.4 抗性汰选步骤
• 3.1.5 烟粉虱对噻虫嗪的抗性监测
• 3.1.6 种群生命表的建立
• 3.1.7 形态指标测量
• 3.1.8 生命表参数统计
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 B型烟粉虱噻虫嗪抗性种群的相对适合度
• 3.2.2 形态学体长体宽的比较
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 B型烟粉虱对噻虫嗪抗性生化机制与交互抗性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试昆虫及饲养
• 4.1.2 供试杀虫剂和试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 生物测定
• 4.1.5 增效剂增效试验
• 4.1.6 蛋白质浓度测定
• 4.1.7 羧酸酯酶（Carboxylesterase）活力测定
• 4.1.8 谷胱甘肽S-转移酶（Glutathions-S-transferase）活力测定
• 4.1.9 多功能氧化酶活力测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 交互抗性研究
• 4.2.2 不同增效剂对噻虫嗪的增效作用
• 4.2.3 解毒酶活力测定
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 B型与ZHJ-1型烟粉虱生物学、形态学特征及解毒酶活力比较研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试昆虫的饲养与维持
• 5.1.2 供试试剂
• 5.1.3 试验仪器
• 5.1.4 种群生命表的建立
• 5.1.5 形态学研究
• 5.1.6 生命表参数统计
• 5.1.7 蛋白质浓度测定
• 5.1.8 羧酸酯酶（Carboxylesterase）活力测定
• 5.1.9 谷胱甘肽S-转移酶（Glutathions-S-transferase）活力测定
• 5.1.10 多功能氧化酶活力测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 种群鉴定
• 5.2.2 发育历期与存活率
• 5.2.3 成虫寿命及产卵量
• 5.2.4 生命表参数分析
• 5.2.5 生命期望曲线分析
• 5.2.6 若虫体长体宽测量
• 5.2.7 解毒酶活性测定
• 5.3 小结与讨论
• 第六章 B型烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体基因的克隆
• 6.1 试验材料与方法
• 6.1.1 供试昆虫
• 6.1.2 载体与菌株
• 6.1.3 主要试剂
• 6.1.4 主要仪器
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 总RNA提取
• 6.2.2 cDNA合成
• 6.2.3 nAChR α亚基基因PCR扩增
• 6.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 6.2.5 PCR纯化产物与载体的连接
• 6.2.6 转化感受态细胞TOP10
• 6.2.7 质粒DNA的提取
• 6.2.8 阳性克隆检测
• 6.2.9 序列测定
• 6.2.10 生物信息学分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 烟粉虱RNA提取
• 6.3.2 α亚基的PCR扩增
• 6.3.3 菌落PCR及质粒酶切
• 6.3.4 核酸序列结果与分析
• 6.4 讨论
• 第七章 噻虫嗪对B型烟粉虱乙酰胆碱受体A亚基MRNA表达的影响
• 7.1 试验材料与方法
• 7.1.1 供试昆虫
• 7.1.2 载体与菌株
• 7.1.3 主要试剂
• 7.1.4 主要仪器
• 7.2 试验方法
• 7.2.1 总RNA提取
• 7.2.2 cDNA合成
• 7.2.3 实时荧光定量PCR引物的设计
• 7.2.4 内参基因的克隆
• 7.2.5 实时荧光定量PCR条件的优化
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 总RNA的提取
• 7.3.2 cDNA的合成
• 7.3.3 传统PCR验证引物特异性
• 7.3.4 内参基因的传统PCR验证
• 7.3.5 实时荧光定量PCR条件的优化
• 7.3.6 标准曲线的建立
• 7.3.7 扩增曲线的建立
• 7.3.8 熔解曲线的建立
• 7.3.9 nAChRsα表达差异的检测
• 7.4 小结与讨论
• 第八章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历