GDNF和LIF对小鼠SSCs体外增殖的影响

论文摘要

精原干细胞（Spermatogonial stem cells, SSCs）是在出生后哺乳动物进行自我更新，并将遗传因子传递给后代的唯一一类细胞。体外SSCs的分离、纯化、鉴定、增殖培养和冷冻保存是后续所有研究的基础。通过收集6～8日龄小鼠睾丸，采用机械法和两步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞，碱性磷酸酶（Alkaline Phoshphatase, AP）染色和反转录聚合酶链式反应（Reverse TranscriptPolymerase Chain Reaction, RT-PCR）检测Ngn3和Oct4基因2种方法进行鉴定。采用单独添加胶质源性神经营养因子（Glial Cell line-derived Neurotrophic Factor, GDNF）或白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs，同时添加GDNF和LIF（各添加量配伍组合）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs，采用甲基噻唑基四唑（Methyl Thiazolyl Tetrazolium, MTT）法检测GDNF和LIF对SSCs体外增殖的单因子效应和配伍效应。同时采用不同浓度的甘油和二甲基亚砜（DimethylSulfoxide, DMSO）冷冻保存SSCs。主要研究结果如下：1.利用1mg/ml IV型胶原酶和0.25%的胰酶两步酶法得到的细胞存活率为90%左右。利用改进的差异贴壁法可将支持细胞和SSCs分离，且得到的SSCs纯度达到80%左右，是一种可靠、简单的SSCs分离纯化方法。AP染色呈现阳性，克隆团被染色为棕色或咖啡色。支持细胞和SSCs均存在β-actin基因，SSCs存在Ngn3基因和Oct4基因，支持细胞不存在Ngn3和Oct4基因。这两种方法表明，试验所分离纯化的细胞即为目的细胞SSCs。2.与对照组相比，不论培养时间长短，单独添加20和40ng/mL的GDNF可以显著促进SSCs的增殖（P＜0.05），而添加不同量LIF对SSCs增殖的影响不显著（P＞0.05）；同时添加20ng/mL GDNF和1000U/mL LIF可以显著促进SSCs增殖，在该条件下当SSCs接种密度为6～10×104mL-1，共培养5d时，其OD490值为0.696。3.在冷冻保存1d后，10%和5%DMSO冷冻保存的SSCs存活率均高于90%，而15%的DMSO冻存的SSCs存活率只有80%，二者差异显著（P＜0.05）。甘油作为保护剂时，SSCs的活率均没有超过30%，在冷冻到第7d时，SSCs的活率低于10%，所以之后的AP染色及体外培养实验终止。冷冻1个月后，用DMSO作为冷冻保护剂时，10%DMSO冻存的SSCs活率显著高于5%DMSO和15%DMSO （P＜0.05），所以用含10%DMSO的冻存液进行SSCs的冷冻保存。10%DMSO+20%FBS+70%DMEM是本研究中SSCs冻后活率最高的一组，基本上维持在78%左右，可作为今后冻存SSCs的冷冻保护剂。将冻存1个月的SSCs解冻后接种于支持细胞饲养层上，在培养24h后发现，SSCs基本贴壁，细胞呈现单个圆形状态；48h之后观察发现，SSCs均增殖，视野中很多成串圆形细胞；5d后细胞增殖组基本形成葡萄串样克隆，7d后细胞增殖形成克隆团。AP染色检测显示SSCs被染成咖啡色，AP阳性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 精原干细胞的研究进展
• 1.1 SSCs 的增殖与再生
• 1.2 SSCs 的标志物
• 1.3 SSCs 的分离与纯化
• 1.4 SSCs 体外增殖培养
• 1.5 SSCs 的移植
• 1.6 SSCs 的诱导分化
• 1.7 SSCs 的应用前景
• 1.7.1 SSCs 在男性不育上的应用
• 1.7.2 SSCs 在再生医学中的应用
• 1.8 本研究的目的和意义
• 试验研究
• 第二章 小鼠精原干细胞分离纯化与鉴定研究
• 前言
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 睾丸单细胞悬液和细胞活率
• 2.2.2 小鼠 SSCs 的分离纯化
• 2.2.3 小鼠 SSCs 的鉴定
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 GDNF 和 LIF 对小鼠精原干细胞的促增殖效应
• 前言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 小鼠支持细胞的培养
• 3.2.2 GDNF 和 LIF 对 SSCs 增殖的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 小鼠精原干细胞的冷冻保存
• 前言
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同浓度的甘油和 DMSO 的冻存效果
• 4.2.2 10%DMSO 冻存的小鼠 SSCs 解冻后体外培养
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 主要溶液的配制
• 附录Ⅱ 小鼠睾丸单细胞悬液的制备
• 附录Ⅲ RT-PCR
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介