成骨细胞对振动应力作用的早期应答及力学信号转导机制的初步研究

论文摘要

研究背景骨质疏松（Osteoporosis,OP）是以骨量减少,骨组织微观结构退化,致使骨脆性增加以及易于发生骨折为特征的一种全身性骨骼系统疾病。OP的主要危害是其并发症——骨折,骨质疏松性骨折是危害中老年人健康的常见病,尤以绝经后妇女为甚。运动是预防和治疗骨质疏松的重要方法之一,研究表明:体育锻炼和增加活动有助于老年患者和绝经后妇女维持骨矿密度,降低OP的危险性。人们已经认识到力学因素在OP的发生、发展过程中具有重要作用。机械振动是力学作用形式之一。研究表明:振动具有良好的促进骨形成和骨重建效应,振动应力（Vibration Stress,VS）有利于骨的成熟与改建,振动强度及振动频率影响振动的成骨效果;目前国内外关于振动频率的研究领域因其实验方法及实验模型不同,得出的结论有很大区别,总的频率范围集中在1～100Hz。力学负荷可以抑制骨吸收,增加骨形成,骨细胞可以将力学信号转变为细胞生物化学合成反应,在治疗OP及预防老年性骨丢失中有广阔的应用前景。但是,这种力学信号转导的机制仍不清楚。目的:1.推测OB在VS作用下所受的应力形式2.获得VS促进OB增殖、分化的适宜振动频率。3.探讨OB对VS作用早期的力学信号转导机制。方法:1.建立体外VS加载OB模型:设计制造VS加载系统,酶消化法分离培养Sprague-Dawley（SD）乳鼠颅骨OB,形态学、特异性酶染色及矿化结节茜素红染色技术鉴定细胞,建立体外VS加载OB模型,在应力加载过程中观察培养皿内液体运动及细胞生长情况。2.将第6代OB随机分为7组:空白对照组（A）、NaF阳性对照组（B）、VS加载组（C～G）:各组对应频率分别为3～10、15～30、25～45、50～80、80～100Hz,其他振动条件相同;各组细胞培养条件相同,A、B组不予振动,C～G组按要求加载VS;单向方差分析比较各组细胞周期、细胞增殖能力及ALP活性的差异。3.将第3代OB随机分为4组:空白对照组（A）、Verapamil组（B）、TTX组（C）、Verapamil+TTX组（D）,每组根据振动时间拆分成0min组和30min组,共8小组;按实验设计干预标本,VS加载频率为15～45Hz;单向方差分析,析因分析及独立样本t检验方法比较各组标本细胞膜电位和细胞内钙离子水平的差异。4.将第3代OB随机分为4组:空白对照组（A）、阻断剂（分别为TTX及Verapamil）组（B）、振动组（C）、振动+阻断剂组（D）;按实验设计干预标本,VS加载频率为15～45Hz;单向方差分析比较各组标本细胞增殖能力及ALP活性的差异。5.将第3代OB随机分为对照组和振动组,根据振动时间不同,每组拆分成4个时间段,分别为0min、20min、40min、60min,共8小组;按实验设计干预标本,VS加载频率为15～45Hz,单向方差分析,析因分析及独立样本t检验方法比较各组标本细胞分泌一氧化氮（Nitric Oxide,NO）活性的差异。结果:1.VS加载系统运行良好,振动参数输出稳定;镜下OB呈长梭形或三角形贴壁生长,经形态学Gimusa染色、矿化结节茜素红染色及ALP钙钴法染色鉴定培养细胞为OB;振动前,培养皿内液体静止,振动过程中,培养皿内液体自中央向外周波动,波纹的形状和波动速率随振动频率而改变,振动组细胞未见脱落、凋亡,生长呈一定方向性,生长速度较空白对照组快;VS加载OB的模型是有效的。2.15～30Hz和25～45Hz频段诱导OB周期循环,促进细胞增殖,增强ALP活性;80～100Hz和3～10Hz频段抑制细胞周期循环;80～100Hz频段抑制细胞增殖;50～80Hz和80～100Hz频段抑制ALP活性;以上差异均有统计学意义（P＜0.01）。3.（1）析因分析交互效应具有统计学意义（F=30.646、P=0.000）;各组（A、B、C、D）不同时间段间差异有统计学意义（F=14.086,P=0.000）,膜电位荧光值由高到低依次为A组（均数286.32）、B组（均数262.01）、C组（均数284.38）、D组（均数255.45）;（2）VS加载OB 0min,各组细胞膜电位荧光强度处于同一基线水平,差异无统计学意义（P=0.081）;VS加载OB 30min,各组细胞膜电位荧光强度均有不同程度升高,差异有统计学意义（P=0.000）;SNK法比较结果,A2与C2之间差异无统计学意义（P=0.444）;（3）各组0min时段与30min时段间膜电位差异有统计学意义（P＜0.05）;A、B、C、D各组时间段荧光强度增加幅度分别为48.69%、30.00%、59.29%、27.30%。4.（1）析因分析交互效应具有统计学意义（F=36.841、P=0.000）;各组（A、B、C、D）不同时间段间差异有统计学意义（F=14.086,P=0.000）,细胞内钙离子浓度荧光值由高到低依次为A组（均数250.75）、B组（均数233.12）、C组（均数237.66）、D组（均数220.71）;（2）VS加载OB 0min,各组细胞内钙离子荧光强度差异有统计学意义（P=0.000）,SNK法比较结果,C1与D1之间差异无统计学意义（P=0.576）;VS加载OB 30min,各组细胞内钙离子荧光强度均有不同程度升高,差异有统计学意义（P=0.000）;SNK法比较结果,B2与D2间差异无统计学意义（P=0.320）;（3）各组0min时段与30min时段间差异均有统计学意义（P＜0.05）;A、B、C、D各组时间段荧光强度增加幅度分别为29.71%、13.90%、32.46%、13.73%。5.（1）TTX对VS促进OB增殖能力的效应无明显影响（P=0.630）,对VS加强OBALP活性的效应具有抑制作用（P=0.004）;（2）VS促进OB增殖及加强ALP活性的效应可被L-钙通道阻断剂Verapamil抑制（P=0.000）。6.（1）析因分析交互效应有统计学意义（F=4.076、P=0.013）;（2）空白组在60min内,4个时段NO分泌量差异无统计学意义（P=0.097）;（3）振动组在60min内,各时段NO分泌量差异有统计学意义（P=0.000）;与0min组比较,20min组、40min组、60min组的P值分别为0.043、0.012、0.000;与20min组比较,40min组增加不明显（P=0.555）,60min组增加明显（P=0.010）,振动组在40min内,NO生成增加缓慢（0.012）,40min后增加明显（P=0.000）;（4）振动组与空白组各时段比较结果:0min时段,空白组NO分泌量较振动组略高,在20min、40min时段,空白组NO生成较均较振动组减少,差异无统计学意义;60min时段,空白组NO分泌量较振动组减少（P=0.007）。结论1.VS加载过程中,OB所受应力形式为流体剪切力。2.不同频率VS对OB周期、增殖能力、ALP活性均有影响,获得VS促进OB增殖及分化的适宜频率为15～45Hz。3.VS激活电压依赖式L-钙通道是OB膜电位去极化、细胞内Ca2+浓度升高的原因之一,细胞内Ca2+浓度及NO活性升高可引起细胞功能活动增强,Ca2+及NO参与了OB早期的力学信号转导。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 骨质疏松简介
• 2 机械振动在骨科应用的概况
• 参考文献
• 第一章 建立振动应力加载成骨细胞模型
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二章 不同频率振动应力对成骨细胞早期增殖、分化的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三章 成骨细胞对振动应力作用的早期力学信号转导机制
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 在读期间学习成果
• 中英文对照缩略词表
• 致谢
• 统计学证明