论文摘要
耐药性金葡菌（methicillin-resistant StapHylococcus aureus, MRSA ）是全球院内感染的首要病原菌。在中国>80 %的金葡菌临床分离株是MRSA,在西方国家>60 %。金葡菌细胞壁肽聚糖合成是由青霉素结合蛋白（Penicillin-binding proteins, PBPs）酶系完成的,PBPs有转糖基酶（transglycosylase domain, TGase）和转肽酶（transpeptidase domain, TPase）两种酶学活性,催化细菌肽聚糖粘肽的交联,以维持细菌固有形态。因肽聚糖为细菌必须,而在哺乳动物的组织和细胞中又不存在,因而细菌肽聚糖及其合成酶系都是药靶的极佳候选者。β-内酰胺类抗生素能抑制其转肽酶活性,进而杀灭敏感菌。但MRSA则能编码一种PBP2a（penicillin binding protein 2a ,PBP2a）分子,对β-内酰胺类抗生素具有较低的亲和力,帮助细菌躲避抗生素的攻击。近年来的研究表明,PBP2a在MRSA肽聚糖合成中只提供转肽酶活性,而转糖基酶活性须由PBP2提供,即MRSA的耐药性是由PBP2和PBP2a共同表达的,均可作为药靶。如果在分子水平将PBP2和PBP2a的功能域融合,构建并表达一嵌合药靶,则可利用该药靶进行TGase或/和TPase活性抑制物的筛选,获得的抑制物可望研发成抗MRSA感染的新药,同时其作用机制也得到阐明,即是通过阻断肽聚糖合成而抑制MRSA的生长,这对预防和控制目前日益严重的耐药性MRSA菌感染具有重要意义。本研究在对MRSA PBP2和PBP2a功能域进行充分分析的基础上,通过分子设计,将PBP2 N-端参与细菌肽聚糖骨架构建的糖基转移酶区（TGase）,与PBP2a C-端参与肽绞链桥形成的转肽酶区（TPase）编码基因分别克隆,再经分子生物学操作构建成TG-TPase嵌合药靶,亚克隆于原核和真核表达载体,实现嵌合药靶的原核、真核表达及嵌合药靶的初步纯化,并在金葡菌体内证实表达了的TG-TPase嵌合药靶具有耐药活性,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。其研究内容和结果主要包括以下几个方面:1.抗耐药性金葡菌嵌合药靶的设计:①金葡菌PBP2分子的序列多重比对分析;②耐药性金葡菌PBP2转糖基酶活性区的结构特点及其活性发挥;③耐药性金葡菌PBP2a转肽酶活性区的结构特点及其耐药机制;④抗耐药性金葡菌嵌合药靶的设计。2.MRSA耐药相关TG-TPase嵌合药靶在原核表达系统中的表达:①利用PCR分别从MRSA基因组上扩增出PBP2a TPase、PBP2 TGase基因,克隆入pMD18-T载体中构建了重组质粒pMD-TG和pMD-TP;②通过酶切连接pMD-TG/Xho I-Not I和pMD-TP/Xho I-Not I片段构建了带有TG-TPase嵌合药靶的重组质粒pMD-TG-TP,并亚克隆入表达载体pET22b+、pET30b+,转化大肠杆菌Rosetta（DE3） plysS;③对pET22b-TG-TP/Rosetta工程菌进行表达,并对表达条件进行摸索,获得的工程菌表达产物经超声裂解后, 90 %以上的融合蛋白质以包涵体的形式存在;④将pET22b-TG-TP/Rosetta工程菌表达得到融合蛋白包涵体经Ni-NTA亲和纯化后,获得纯度达90 %以上的目标蛋白,并对蛋白进行质谱和Western blotting鉴定;⑤将纯化好的融合蛋白质经透析法复性,并采用Bradford法进行蛋白质定量后,冻存备用;⑥为获得融合蛋白抗体,将融合蛋白免疫Balb/c小鼠,得到相应抗体后加等体积甘油冻存备用。3.MRSA耐药相关TG-TPase嵌合药靶重组毕赤酵母的构建与表达:①将TG-TPase嵌合药靶插入真核表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-TG-TP重组质粒;②将构建好的重组质粒经Sal I酶切线性化后,电转化整合入GS115毕赤酵母中,用浓度逐渐增加的G418来筛选多拷贝菌株,并鉴定其表型;③对筛选出的菌株在DNA、mRNA及蛋白水平进行鉴定。结果表明,通过提取转化子的基因组进行PCR扩增,可得到约1 923 bp大小的片段,经过对转化子的诱导表达,RT-PCR可扩增出约1 923 bp大小的片段,均与预期结果一致。4.MRSA耐药相关TG-TPase嵌合药靶在金黄色葡萄球菌中的表达及体内活性鉴定:①利用PCR分别从MRSA基因组上扩增出PBP2a TP’ase、PBP2 TG’ase基因,克隆入pMD18-T载体中构建了重组质粒pMD-TG’和pMD-TP’;②通过酶切连接pMD-TG’/Xho I-Not I和pMD-TP’/Xho I-Not I片段构建了带有TG-TP’ase嵌合药靶的重组质粒pMD-TG-TP’;③重组质粒pMD-TG-TP’亚克隆入金葡菌表达载体pYT3,构建了pYT3-TG-TP’重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,待重组质粒鉴定正确后再电转入金葡菌N315;④重组质粒在N315菌中进行修饰后再转入MSSA中;⑤应用96孔板稀释法测定了6种抗生素（苯唑西林、注射用亚胺培南、头孢氨苄、加替沙星、萘夫西林、盐酸万古霉素）对pYT3-TG-TP’/MSSA的MIC和MBC,并对重组菌的体外生长抑制曲线进行了测定,检测结果显示重组工程菌MIC和MBC有不同程度的改变,其中对苯唑西林、头孢氨苄、加替沙星、萘夫西林的MIC和MBC值改变较为明显;重组菌体外生长抑制曲线测定,显示苯唑西林、头孢氨苄、加替沙星、萘夫西林4种抗生素在不同浓度时对pYT3-TG-TP’/MSSA、pYT3/MSSA和MSSA菌密度之间的关系和体外杀菌效果,有效杀菌结果与其MIC值相同,证明了所构建的重组工程菌pYT3-TG-TP’/MSSA具有了多重耐药活性。综上所述,本研究设计了抗耐药性金葡菌嵌合药靶,并进行了TG-TPase嵌合药靶的原核和真核表达,并在原核表达后,经包涵体提取、变性、复性等实验,纯化得到了嵌合药靶蛋白,为体外酶学活性实验奠定了基础。本研究还将TG-TPase嵌合药靶在药物敏感金黄色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA）中进行了表达及活性研究,在细菌体内证实药靶分子的生物学功能,为该药靶分子的进一步开发利用提供理论依据。
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- [1].潜在药靶的发现和验证[J]. 世界临床药物 2010(03)
- [2].抗耐药性金黄色葡萄球菌嵌合药靶的设计与构建[J]. 免疫学杂志 2011(08)
- [3].用于新药筛选的药靶的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报 2008(09)
- [4].基于代谢网络识别共病性疾病对的潜在药靶[J]. 哈尔滨医科大学学报 2020(01)
- [5].类风湿关节炎蛋白质代谢的研究进展[J]. 安徽医药 2010(02)
- [6].结核杆菌细胞壁相关潜在药物靶标的生物信息学分析[J]. 第四军医大学学报 2008(22)
- [7].量子点在新药开发中的应用[J]. 生命的化学 2008(06)
- [8].秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用[J]. 上海医药 2011(11)
- [9].RNAi鉴定药物靶点及siRNAs治疗疾病[J]. 重庆教育学院学报 2008(06)
- [10].马尔尼菲青霉菌药靶基因发掘与利用[J]. 中国新技术新产品 2008(17)
- [11].念珠菌的耐药机制及应对策略研究[J]. 中国真菌学杂志 2011(04)
- [12].蛋白质组学技术筛选新的卵巢癌多药耐药靶向蛋白的研究进展[J]. 现代妇产科进展 2009(07)
- [13].我国科研人员找到多发性硬化病潜在药靶[J]. 临床荟萃 2010(11)
- [14].针对药靶基因PDCD10和MST4抑制剂体外筛选方法的建立及化合物的筛选[J]. 南京医科大学学报(自然科学版) 2010(11)
- [15].RNAi在药物研究中的研究进展[J]. 三明学院学报 2009(04)
- [16].以血管内皮生长因子及其受体为药靶的抗肿瘤药物的研究进展[J]. 成都医学院学报 2011(03)
- [17].降血糖药物及其作用靶点研究[J]. 中国误诊学杂志 2011(36)
- [18].病毒跨膜蛋白的结构功能与抗病毒药物设计[J]. 微生物与感染 2009(04)