土壤中放线菌参与反硝化可能性研究

论文摘要

长期以来,人们提到反硝作用首先想到的就是反硝化细菌。上世纪90年代之前大量文献也确实表明当时已知的反硝化菌都是细菌。从1997年起,国外很多学者相继发现在纯培养条件下许多放线菌都能将15NO3–还原为15N2O,这些放线菌涉及多达11个属,且报道的大多为链霉菌属。对土壤中放线菌参与土壤反硝化可能性进行了初步研究。从土壤10–5稀释液中共获得23个放线菌单菌落,初步鉴定属于10个不同类型的菌株,其中9个属于Streptomyces（链霉菌属）,1个属于Actinomadura（马杜拉属）。10个菌株在纯培养条件下都能将NO3–还原成N2O,表明该土壤中具有反硝化能力的放线菌比例很高。测得其中3个链霉菌菌株的N2O产出速率为N 1.2–187.7μg g–1min–1（细胞干重基数）。N2O形成与放线菌生物量成正比。多数链霉菌菌株的N2O产出受C2H2抑制。将3个链霉菌菌株接种到灭菌土壤中厌气培养,均能测到N2O形成,表明链霉菌可以利用土壤中原有碳源作为电子供体还原NO3–。经历厌氧胁迫21d以后,测试的3株链霉菌菌株至少能保留一部分反硝化能力。本文从苏州土样中用稀释平板法分离了大量的放线菌,并尝试了最新的反硝化菌检测方法——gfp–报告基因检测法进行了检测,发现其中的5号菌株能使带有gfp（green fluorescent protein）基因的Agrobacterium tumefaciens C58（AT–Nir）在紫外线激发下发出荧光。反硝化酶可以分泌到胞外并被土壤颗粒吸附。现有测定土壤反硝化活性的方法中并不区分胞外和胞内反硝化酶的贡献,因此一般将测得的土壤反硝化活性归功于反硝化细菌的作用。但是很多研究表明,土壤中反硝化细菌数量与反硝化活性之间并不总呈比例关系,因此有必要区分分胞外和胞内反硝化酶的贡献。本文将Agrobacterium tumefaciens C58（AT）培养–离心–清洗,获得纯细胞,测定细胞浓度和纯细胞的反硝化活性,折算成单位细胞个数的反硝化活性。另外将A.tumefaciens C58加入土壤,加入培养基培养一段时间后（预培养）,测定细胞数量和土壤反硝化活性,折算成单位细胞个数的反硝化活性。上述两种处理所得结果表明,预处理过的单位细胞个数的反硝化活性明显高于纯细胞的反硝化活性,表明胞外反硝化酶对反硝化活性有明显的贡献,现有方法测得的土壤反硝化活性不能完全归功于土壤中现有反硝化细菌细胞。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 第一节 氮素循环与反硝化
• 1. 自然界中的氮素循环
• 2. 反硝化作用的研究意义
• 3. 反硝化作用的生化原理
• 第二节 反硝化研究现状
• 1. 反硝化作用研究现状
• 2. 反硝化作用机制
• 3. 反硝化影响因素
• 4. 反硝化细菌
• 5. 反硝化放线菌
• 第一章 土壤中放线菌参与反硝化可能性研究
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果与讨论
• 1.3 小结
• 第二章 gfp–报告基因法检测放线菌反硝化
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果与讨论
• 第三章 反硝化酶活性测定
• 3.1 材料与方法
• 3.2 实验原理
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验结果与讨论
• 参考文献
• 致谢