海洋细菌Cellulophaga sp. QY201的λ-卡拉胶酶研究

论文摘要

卡拉胶是由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖交替连接而成的线性硫酸多糖。根据是否含有3,6-内醚半乳糖结构以及硫酸基的含量的不同,目前工业上生产和使用的卡拉胶主要为κ-型、ι-型和λ-型三种,其二糖单元分别含有1个、2个和3个硫酸基。卡拉胶寡糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性,尤其是λ-卡拉胶寡糖,它含有多个硫酸基,可能具有更好的生理活性,有望成为新一代的海洋药物。卡拉胶酶（Carrageenase）是一种糖水解酶,它降解卡拉胶的β-1,4糖苷键产生卡拉胶低聚糖。卡拉胶酶不但能作为工具酶用于卡拉胶寡糖的制备,还能用于藻类原生质体的制备和卡拉胶结构的研究,在医药、食品、农业等多个领域具有广泛的应用价值。目前国内外对κ-和ι-卡拉胶酶研究较多,而对λ-卡拉胶酶的报道很少。因此,寻找高活力的新型λ-卡拉胶酶具有重要的理论意义和明确的应用前景。本实验室从舌状蜈蚣藻表面分离到一株产胞外κ-、ι-和λ-卡拉胶酶的菌株Cellulophaga sp. QY201,本文对该菌株液体发酵条件进行了优化,确定其产λ-卡拉胶酶的最优培养基为（w/v）:3% NaCl,0.3% MgSO4·7H2O,0.02% CaCl2,0.01% KCl,0.002% FeSO4,0.3% Casein,0.15% Na2HPO4,0.1% NaH2PO4,0.25%λ-卡拉胶,起始pH为7.0;最适培养条件是:500mL摇瓶装液量为150mL,培养温度为28℃,培养时间为36 h。在最适产酶培养条件下,发酵液中λ-卡拉胶酶活力可达到3.6 U/mL,为优化前的3.5倍。利用硫酸铵沉淀、DEAE离子交换层析、Superdex 75 HR凝胶过滤层析技术,从Cellulophaga sp. QY201发酵液上清中分离纯化到一种λ-卡拉胶酶,比活力为8 U/mg,纯化倍数为40倍,回收率为3%。SDS-PAGE显示为单一条带,酶的分子量为38.0 kD,溶液状态下为单体结构。Cellulophaga sp. QY201λ-卡拉胶酶的酶学性质研究结果表明,其最适反应温度为30℃,在0-30℃之间酶活力较稳定;最适反应pH为7.5,在pH 6.0-8.5之间较稳定; Na+、K+、Cu2+、Mg2+对酶活性有促进作用,Fe2+、Ba2+、Mn2+、（NH4）2SO4、Ni2+以及EDTA对酶活性有抑制作用。该酶对λ-卡拉胶的Km值为4.926×10-6 mol/L。酶的底物特异性分析结果表明,该酶主要降解λ-卡拉胶,对ι-卡拉胶、κ-卡拉胶和琼胶具有很微弱的降解作用。该λ-卡拉胶酶为内切酶;MALDI-TOF-MS分析表明,它专一性水解λ-卡拉胶的α-2,6-硫酸-D-半乳糖和β-2-硫酸-D-半乳糖之间的β-1,4-糖苷键,最终产物为硫酸新λ-卡拉四糖和硫酸新λ-卡拉二糖。利用P-6凝胶过滤柱对它们进行了有效的分离,得到了二糖和四糖的纯品。综上所述,本文利用硫酸铵沉淀、离子交换层析及凝胶过滤层析技术从Cellulophaga sp. QY201的发酵上清液中分离到一种λ-卡拉胶酶。酶的分子量和降解产物分析表明该酶是一种结构和功能全新的糖水解酶。它的发现丰富了λ-卡拉胶酶的多样性,将推动糖生物学研究的发展,同时也将为海洋寡糖类创新药物的研究与开发创造条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 卡拉胶
• 1.1 卡拉胶的结构与分类
• 1.2 卡拉胶的理化性质
• 1.3 卡拉胶的应用
• 1.3.1 卡拉胶在食品、工业方面的应用
• 1.3.2 卡拉胶在医药方面的应用
• 2 卡拉胶寡糖
• 2.1 卡拉胶寡糖的生物活性
• 2.2 卡拉胶寡糖的测定方法
• 3 卡拉胶酶
• 3.1 卡拉胶酶的来源
• 3.2 卡拉胶酶的分类
• 3.3 卡拉胶酶的研究进展
• 3.3.1 κ-卡拉胶酶
• 3.3.2 ι-卡拉胶酶
• 3.3.3 λ-卡拉胶酶
• 3.4 卡拉胶酶的应用
• 3.4.1 用于制备卡拉胶低聚糖
• 3.4.2 用于海藻遗传工程
• 3.4.3 用于研究卡拉胶的结构
• 3.4.4 用于研究细菌的卡拉胶代谢
• 3.5 小结
• 4 前期工作与展望
• 第一章 Cellulophaga sp.QY201 的发酵条件优化
• 1 材料与仪器
• 1.1 仪器
• 1.2 菌株
• 1.3 试剂
• 1.4 常用缓冲液
• 2 实验方法
• 2.1 卡拉胶酶活力测定
• 2.2 蛋白质含量的测定
• 2.3 碳源对Cellulophaga sp.QY201 生长和产酶能力的影响
• 2.4 氮源对Cellulophaga sp.QY201 产酶能力的影响
• 2.5 无机盐对产酶的影响
• 2.5.1 NaCl对产酶的影响
• 2.5.2 金属离子对产酶的影响
• 2.6 培养条件的选择
• 3 结果与讨论
• 3.1 碳源浓度对产酶的影响
• 3.2 氮源浓度对产酶的影响
• 3.3 无机盐对产酶的影响
• 3.3.1 NaCl对产酶的影响
• 3.3.2 金属离子对产酶的影响
• 3.4 培养条件的选择
• 3.4.1 培养基pH对产酶的影响
• 3.4.2 培养温度对产酶的影响
• 3.4.3 培养基体积对产酶的影响
• 3.5 讨论
• 4 小结
• 第二章 λ-卡拉胶酶的分离纯化
• 1 材料与仪器
• 1.1 仪器
• 1.2 菌株
• 1.3 试剂
• 1.4 常用缓冲液
• 2 实验方法
• 2.1 粗酶液的制备
• 2.2 酶的分离纯化
• 2.2.1 硫酸铵沉淀粗分离
• 2.2.2 G-25 柱脱盐
• 2.2.3 离子交换层析
• 2.2.4 凝胶过滤层析
• 2.2.5 SDS-PAGE
• 3 结果与讨论
• 3.1 离子交换层析
• 3.2 凝胶过滤层析
• 3.3 分离纯化结果
• 3.4 SDS-PAGE电泳
• 3.5 讨论
• 4 小结
• 第三章 λ-卡拉胶酶的性质研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 常用缓冲液
• 2 实验方法
• 2.1 卡拉胶酶的生化性质检测
• 2.1.1 反应最适温度
• 2.1.2 温度对酶活稳定性的影响
• 2.1.3 反应最适pH
• 2.1.4 pH对酶活稳定性的影响
• 2.1.5 EDTA、金属离子对酶活性的影响
• 2.1.6 底物特异性实验
• 2.1.7 酶促反应动力学参数的测定
• 2.2 卡拉胶酶的降解产物
• 2.3 卡拉胶酶的降解方式
• 2.4 卡拉胶寡糖的制备
• 2.5 卡拉胶寡糖的含量测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 Cellulophaga sp.QY201λ-卡拉胶酶的性质分析
• 3.1.1 温度对酶活性的影响
• 3.1.2 pH对酶活性的影响
• 3.1.3 EDTA、金属离子对酶活性的影响
• 3.1.4 酶的底物特异性
• 3.1.5 酶的米氏常数的确定
• 3.2 卡拉胶酶的降解产物分析
• 3.3 卡拉胶胶酶的作用方式
• 3.4 讨论
• 4 小结
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间撰写的文章