猪CART和AgRP基因启动子的克隆与活性分析

论文摘要

猪是大型的经济动物,体脂性状是影响其市场价值的重要指标。近年来的研究认为,CART与AgRP基因通过参与脂肪代谢的调控,影响机体的摄食行为和能量平衡。本文通过对猪的CART与AgRP基因启动子的克隆与活性分析,为进一步了解CART和AgRP基因在猪体内参与的脂肪代谢调控机制,以及为开发和建立猪的标记辅助育种提供有价值的资料。本研究通过猪BAC文库筛选,焦磷酸测序,获得CART与AgRP基因的5’侧翼序列,在此基础上,运用启动子双报告基因载体瞬时转染实验、EMSA（凝胶阻滞分析）实验,分析了这两个基因的启动子以及其他重要顺式元件,研究了CART与AgRP基因在猪各种组织的表达特征及其可能遗传机制,为进一步揭示这些基因的表达调控规律奠定基础。本研究的主要结果如下:（1）获得猪CART基因转录起始位点上游793bp与AgRP基因起始密码子上游1278bp的5’侧翼序列。（2）RT-PCR结果表明猪CART与AgRP基因广泛的表达于中枢以及外周组织。（3）启动子活性分析以及EMSA实验表明猪的CART基因启动子区域内的-73-53bp之间可能有一个正调控元件在起作用,该元件是一个锌指蛋白,属于Kruppel家族的成员,在人类及啮齿类中未见报道。（4）启动子活性分析及EMSA实验表明猪的AgRP基因启动子区域内可能有两个正调控元件起作用,一个是位于-501-479区域内,是一个神经源分化因子（NeuroD）,属于bHLH转录因子家族的一员,另外一个是位于非编码的外显子1。结合前人的研究结果,本文认为CART与AgRP基因是影响脂肪沉积的重要候选基因,阐明其调控机理对治疗人类的肥胖和改善动物体脂性状都有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 可卡因-安非他明调节转录肽（CART）
• 1.1.1 CART 肽的的发现与分布
• 1.1.2 CART 的基因结构及其转录调节
• 1.1.3 CART 在摄食和肥胖过程中的作用
• 1.1.4 CART 对食欲和体脂含量的调节机制
• 1.2 Agouti 相关蛋白（AgRP）
• 1.2.1 AgRP 肽的的发现与分布
• 1.2.2 AgRP 的基因结构及其转录调节
• 1.2.3 AgRP 蛋白参与摄食和肥胖的发生
• 1.2.4 AgRP 对食欲和体脂含量的调节机制
• 1.3 启动子研究进展
• 1.3.1 启动子及其特征
• 1.3.2 启动子的克隆和分析
• 1.4 本论文的研究内容与意义
• 1.5 技术路线
• 第二章 猪 CART 基因启动子的克隆和调控区的鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 细胞株、菌株和载体
• 2.2.2 工具酶、试剂和分子生物学试剂盒
• 2.2.3 试剂配制
• 2.2.4 主要仪器设备
• 2.3 方法
• 2.3.1 BAC 文库的筛选
• 2.3.2 BAC 的提取、酶切与纯化回收及测序
• 2.3.3 转录起始位点和转录因子结合位点的预测
• 2.3.4 启动子5’-系列相向缺失片段重组质粒的构建
• 2.3.5 细胞培养
• 2.3.6 细胞瞬时转染
• 2.3.7 双荧光素酶报告基因活性测定
• 2.3.8 凝胶阻滞实验（EMSA）
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 BAC 文库的筛选
• 2.4.2 BAC 的提取、酶切与纯化回收及测序
• 2.4.3 转录起始位点和转录因子结合位点的预测
• 2.4.4 CART 基因启动子5’-系列相向缺失片段重组质粒的构建
• 2.4.5 细胞瞬时转染与启动子活性分析
• 2.4.6 凝胶阻滞实验（EMSA）
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第三章 猪 AgRP 基因启动子的克隆和调控区的鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 细胞株、菌株和载体
• 3.2.2 工具酶、试剂和分子生物学试剂盒
• 3.2.3 试剂配制
• 3.2.4 主要仪器设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 BAC 文库的筛选
• 3.3.2 BAC 的提取、酶切与纯化回收及测序
• 3.3.3 转录起始位点和转录因子结合位点的预测
• 3.3.4 启动子5’-系列相向缺失片段重组质粒的构建
• 3.3.5 细胞培养
• 3.3.6 细胞瞬时转染
• 3.3.7 荧光素酶活性测定
• 3.3.8 凝胶阻滞实验（EMSA）
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 BAC 文库的筛选
• 3.4.2 BAC 的提取、酶切与纯化回收及测序
• 3.4.3 转录起始位点和转录因子结合位点的预测
• 3.4.4 AgRP 基因启动子5’-系列相向缺失片段重组质粒的构建
• 3.4.5 细胞瞬时转染与启动子活性分析
• 3.4.6 凝胶阻滞实验（EMSA）
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第四章 猪CART 与AgRP 基因的组织表达与分布
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 用于组织表达分析的样本
• 4.2.2 分子生物学试剂
• 4.3 方法
• 4.3.1 RNA 的提取
• 4.3.2 总RNA 检测及浓度测定
• 4.3.3 总RNA 反转录
• 4.3.4 管家基因（β-actin）验证cDNA 的合成
• 4.3.5 各组织的RT-PCR 分析
• 4.4 结果
• 4.4.1 总RNA 的提取
• 4.4.2 各组织的RT-PCR 分析
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 答辩委员会对论文的评定意见