绵羊胚胎体外生产技术的研究

论文摘要

体外受精技术即体外胚胎生产技术一直是辅助繁育新技术的研究热点。但目前绵羊的体外受精技术体系还不是很成熟,本实验使用屠宰场获得的绵羊卵巢旨在研究绵羊体外成熟、体外受精（IVM/IVF）及早期胚胎培养中的影响因素,以期筛选出较为合理的绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎发育培养体系。 结果表明: 1 切剖法从屠宰绵羊卵巢表面卵泡采集得到的可用卵母细胞数显著多于抽吸法（4.47枚/卵巢VS2.51枚/卵巢）,但耗时较长（55秒vs51秒）。 2 添加不同剂量的FSH均能刺激卵母细胞的体外成熟,且各组间卵母细胞的成熟率没有显著差异（P>0.05）;但是,添加1μg/ml和5μg/mlFSH的成熟培养液得到的卵裂率都显著大于添加10μg/ml FSH的成熟培养液（P<0.05）。 3 表明绵羊成熟培养液中添加一定剂量的EGF能够显著提高卵母细胞的成熟率,且100ng/ml的EGF添加浓度与0ng/mlEGF及50ng/mlEGF添加浓度相比较还能显著提高受精后绵羊卵母细胞的卵裂率,建议为合适添加浓度。 4 培养液中一定浓度范围内颗粒细胞（浓度为2-6×106个/ml）的存在对卵母细胞体外成熟率没有明显的影响,但能显著的提高卵母细胞受精后的卵裂率（55.6%vs53.8%）和桑囊率（28.9%vs19.1%）（P<0.05）。 5 公羊个体对体外受精结果的影响不容忽视。实验结果表明,来自三只不同公羊的精液经相同的获能处理,进行卵母细胞体外受精,结果在卵裂率（54.7%,41.3%,43.3%）和桑堪胚/囊胚率（28.2%,19.7%,22.6%）上都有显著差异（P<0.05） 6 绵羊受精16小时的卵裂率、桑囊率显著高于受精8小时、12小时和20小时。 7 四种培养液Ⅰ液:TCM199+GCM+15%ESS+EGF;Ⅱ液:TCM199+15%ESS+EGF;Ⅲ液:SOF液+15%ESS+10μg/ml NEAA+20μg/mlEAA+EGF;Ⅳ液:SOF液+BSA+10μg/mlNEAA+20μg/mlEAA+EGF与受精后的胚胎共培养,结果表明,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液卵裂率显著大于Ⅳ组培养液（P<0.05）,Ⅰ液显著大于Ⅱ液（P<0.05）,Ⅲ液与Ⅰ、Ⅱ液间差异不显著。四组胚胎发育培养液之间所得的桑囊率在Ⅰ液中较高但与其它三组差异不显著（P>0.05）。 8 绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎培养的TCM199体外受精渐变培养体系与目前沿用的常规体外受精体系相比较,虽然成熟率差异不显著（81.3%vs80.4%）,但卵母细胞体外受精后的卵裂率（72.1%vs50.8）和桑囊率（94.8%vs24.5%）差异极显著（P<0.01）。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 第一章 文献综述-体外受精技术的研究进展
• 1 卵母细胞的获取方法
• 2 卵母细胞的体外成熟
• 2.1 卵母细胞成熟分裂过程
• 2.2 卵母细胞成熟的形态学特征
• 2.3 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 2.4 卵母细胞IVM的研究进展
• 3 精子获能和体外受精
• 3.1 影响精子体外获能的因素
• 3.2 精子体外获能及体外受精的研究进展
• 4 早期胚胎培养体系
• 5 IVF技术发展的制约因素
• 第二章 实验研究
• 引言
• 1 材料
• 1.1 主要仪器及设备
• 1.2 实验材料
• 1.3 主要试剂
• 2 主要操作液
• 3 体外受精程序
• 3.1 卵巢的采集及卵母细胞的收集和筛选
• 3.2 卵母细胞的体外成熟培养
• 3.3 精子获能、体外受精及检测
• 3.4 受精卵的体外培养
• 4 绵羊体外受精实验设计
• 4.1 绵羊卵巢卵母细胞采集方法的对比实验
• 4.2 绵羊卵母细胞的体外成熟
• 4.3 体外受精
• 4.4 四种培养液培养早期胚胎效果的对比
• 4.5 TCM199体外受精渐变培养体系的初步试验
• 第三章 实验结果
• 1 卵巢卵母细胞不同采集方法的效果比较
• 2 卵母细胞的体外成熟
• 2.1 FSH不同添加量对卵母细胞体外成熟及卵裂的影响
• 2.2 成熟液中添加不同浓度的 EGF对卵母细胞成熟、受精及卵裂的影响
• 2.3 添加颗粒细胞对卵母细胞体外成熟、卵裂及受精卵发育的影响
• 3 体外受精
• 3.1 不同公羊个体对体外受精的影响
• 3.2 不同受精时间对卵母细胞体外受精的影响
• 4 四种不同培养液对早期胚胎培养效果的对比
• 5 TCM199体外受精渐变培养体系的初步试验
• 第四章 讨论
• 1 卵巢卵母细胞不同采集方法的效果比较
• 2 FSH不同添加量对卵母细胞体外成熟及卵裂的影响
• 3 成熟液中添加不同浓度的EGF对卵母细胞成熟、受精及卵裂的影响
• 4 添加颗粒细胞对卵母细胞体外成熟、卵裂及受精卵发育的影响
• 5 不同公羊个体对体外受精的影响
• 6 不同受精时间对卵母细胞体外受精的影响
• 7 四种不同培养液对早期胚胎发育的影响
• 8 TCM199体外受精渐变培养体系对绵羊卵母细胞IVM-IVF-IVC的影响
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附图
• 个人简介