论文题目: 人HsSAD1基因的克隆和特征分析暨HsSAD1蛋白激酶功能为14-3-3所调节的机制研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 叶光明
导师: 谈家桢,余龙
关键词: 蛋白激酶,负性调节,基因克隆,内质网
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 在真核生物中，大多数信号传导事件均受蛋白激酶所调节。通过对底物活性的修饰，蛋白激酶控制着细胞的多种生理过程，包括代谢、转录、细胞周期进程、细胞骨架重排，以及细胞运动、凋亡、和分化等。我们应用蛋白质重要功能域同源筛选策略，克隆到一个人类BRSK激酶家族的新成员HsSAD1。该基因全长3109bp，编码778个氨基酸，含有19个外显子，定位于染色体19q13.4。在HsSAD1的N端34-285位氨基酸含有一个典型的Ser／Thr蛋白激酶结构域。体外激酶实验证实HsSAD1具有激酶活性，而它的K63M突变体则缺乏激酶活性。发现激酶活性对于维持HsSAD1的亚细胞定位是必须的，在HEK293T细胞中的定位实验显示该激酶的野生型呈全细胞分布，而该激酶的失活突变型仅分布于胞质。人体16种组织的表达谱分析显示HsSAD1主要在脑和睾丸中呈现高表达，而在心脏，前列腺，胸腺，胰腺以及子宫中仅显示低水平表达；脑各区域的表达谱分析进一步显示，该基因在小脑、大脑皮质、延髓、枕叶、颞叶、额叶、壳核中均呈高表达，而在脊髓的表达丰度则较低。此外，通过对人脑cDNA文库的酵母双杂交筛选，发现多个可以与HsSAD1互作的分子，如RanBPM、MAP1B和14-3-3β等。由于BRSK家族的激酶是一个非持续激活的激酶，而是可能需要其它互作蛋白对其激酶活性状态进行间歇的调节。基于酵母双杂交筛选的互作蛋白中，有一个14-3-3β蛋白，该蛋白家族成员正是多种蛋白激酶的调节蛋白。为此，我们通过免疫共沉淀和GST-pulldown的方法，分别从体内和体外实验验证了14-3-3β蛋白正是HsSAD1的调节蛋白之一。然而人类的14-3-3蛋白家族具有β、η、γ、σ、τ、ε、ζ7个不同的亚型，这些亚型虽然从结构上是高度保守的，功能上却不完全一致。为了解HsSAD1与这些14-3-3蛋白的互作是否具有亚型的特异性，我们又克隆了人类除14-3-3β以外的6个亚型，并验证了它们和HsSAD1的互作，发现仅有14-3-3β、η、γ、σ亚型能和HsSAD1相互作用。因为与14-3-3蛋白结合的配体蛋白通常为磷酸化蛋白，为了求证和14-3-3β蛋白结合的HsSAD1激酶是否为磷酸化蛋白，一方面我们分别突变了14-3-3蛋白上能结合磷酸化蛋白的关键氨基酸51位赖氨酸、58位和129位的精氨酸为丙氨酸(14-3-3βK51A R58Aand 14-3-3βR129A)，验证了突变了的14-3-3蛋白不能与HsSAD1互作；另一方面发现用λ-PPase磷脂酶去除了磷酸化的HsSAD1也失去和GST14-3-3β互作的能力。我们发现激酶的活性丧失后则两者的相互作用消失，同时又发现HsSAD1激酶具有自身磷酸化的特性。这些结果提示HsSAD1的自身磷酸化产生了14-3-3蛋白的结合位点。为了确定HsSAD1与14-3-3β的作用区域，我们将HsSAD1蛋白从C端进行缺失突变体的构建。通过互作实验将HsSAD1与14-3-3的互作区域局限于HsSAD1蛋白的349-500位氨基酸。最后我们调查了14-3-3蛋白与HsSAD1的互作对HsSAD1的功能影响。我们发现细胞中14-3-3β的过量表达可以抑制HsSAD1的激酶活性；重组表达的14-3-3β蛋白也能抑制HsSAD1的激酶活性。这些结果表明14-3-3蛋白不但是激酶HsSAD1的互作蛋白，同时也是HsSAD1活性调节蛋白。在细胞周期试验中，我们发现14-3-3β蛋白能部分减弱HsSAD1诱导的G2／M期的阻滞。该结果进一步说明了14-3-3蛋白是HsSAD1功能作用的重要调节蛋白。另外，我们报道了一个新的人类1-脂酰甘油-3-磷酸-酰基转移酶基因AGPAT7的克隆与特征。1-脂酰甘油-3-磷酸-酰基转移酶是真核生物甘油酯类的生物合成中的一个关键酶。迄今为止，在人的1-酰基甘油-3-磷酸-酰基转移酶家族中已经报道了6个成员，分别命名为APGAT1-6。我们发现的AGPAT7基因定位于染色体15q24区段。该基因编码524个氨基酸；在123-234氨基酸处有一个酰基转移酶结构域。人18种组织中的表达谱分析显示，AGPAT7在子宫，胸腺，胰腺，骨骼肌，膀胱，胃，肺和睾丸组织中有广泛表达。Hela细胞的亚细胞定位结果显示该酰基转移酶主要定位于细胞内质网上。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 人HsSAD1基因的克隆和特征分析暨HsSAD1蛋白激酶功能为14-3-3所调节的机制研究
前言
第一节 HsSAD1基因的克隆及其特征的初步研究
材料和方法
结果
1.HsSAD1基因的克隆
2.HsSAD1蛋白结构特征分析
3.HsSAD1基因的染色体定位和基因组结构分析
4.HsSAD1基因的组织表达特征
5.HsSAD1激酶活性分析
6.HsSAD1的亚细胞定位
7.酵母双杂筛选互作蛋白
讨论
第二节 HsSAD1蛋白激酶功能为14-3-3所调节的机制研究
材料和方法
结果
1.HsSAD1与14-3-3β蛋白在体内与体外相互作用分析
2.HsSAD1与14-3-3蛋白的互作具有14-3-3蛋白亚型的特异性
3.HsSAD1与14-3-3蛋白的互作依赖于HsSAD1磷酸化
4.HsSAD1与14-3-3蛋白的互作依赖于HsSAD1激酶活性
5.HsSAD1与14-3-3β的作用区域局限于HsSAD1的349-500aa
6.14-3-3蛋白能负调节HsSAD1的激酶活性
7.HsSAD1对细胞的功能作用受14-3-3蛋白调节
讨论
参考文献
小结
第二部分 人类AGPAT7基因的克隆和功能的初步研究
前言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
文献综述
参考文献
缩略词表
博士期间发表的论文和参与的编著
致谢
发布时间: 2007-06-28
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