用AFLP技术筛选淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关分子标记

论文摘要

蚊媒病是全世界最重要的人类传染病之一，严重危害人类身心健康。化学防制是控制蚊媒病的一个重要手段。实践证明杀虫剂对于控制蚊媒病的传播非常有效。然而随着杀虫剂的长期、大量使用，蚊媒的抗药性也随之发生和发展。抗药性已成为当前控制蚊媒病的最大障碍。发现并研究新的抗药性靶标将有助于阐明抗药性的分子基础和寻找抗药性的治理方法。大量研究表明，蚊杀虫剂抗性性状是一种数量性状。因此，建立蚊抗性-敏感杂交系，筛选遗传标记，是研究蚊的抗性遗传机理和防制的重要基础。本研究首先采用淡色库蚊溴氰菊酯抗性（R）、敏感（S）品系进行正、反交，得到两个杂交F2代群体，并对比观察其生物学特性；以WHO成蚊接触筒生物测定法将F2个体的表型区分为10-60分钟击倒时间点和24小时恢复与未恢复8种表型，采用生存分析法分析蚊在溴氰菊酯选择压力下的生存情况；接着，采用分群分析法（BSA法）对杂交F2代溴氰菊酯抗性相关的分子标记进行筛选分析。用AFLP引物筛选所建立的抗药性2个极端水平基因池，得到与溴氰菊酯抗性性状紧密连锁的特异性DNA片段；并分别在F2抗性、敏感群体中进行验证。本研究通过淡色库蚊溴氰菊酯抗性、敏感品系进行正、反交，获得杂交F2代群体，观察到其溴氰菊酯抗性水平位于两亲本之间，符合孟德尔的遗传规律。此外，以抗性品系为母本的杂交群体的抗性水平高于以敏感品系为母本的杂交群体。以WHO成蚊接触筒生物测定法，将487只F2个体的表型区分为10-60分钟击倒时间点和24小时恢复与未恢复8种表型。并以此，编制了淡色库蚊杂交品系在杀虫剂选择压力下的生命表和生存曲线，证明R-S组生存率显著高于S-R组，而且分组因素，即亲本，为影响生存率的独立因素。以上结果均表明，抗药性相关的基因可能与性染色体连锁，母本可能提供更多的抗药性相关基因。利用BSA方法，对淡色库蚊抗性、敏感杂交F2代溴氰菊酯抗性相关的AFLP分子标记进行筛选分析。用136对AFLP引物反复筛选所建立的2个抗药性水平基因池，其中29对引物组合所扩增出的稳定可重复的108条多态性显性条带，这些条带可能与抗药性基因连锁，提示其周围可能存在抗药性基因。挑选在亲本之间扩增出稳定可重复的多态性条带的29对引物，分别在F2代溴氰菊酯抗性、敏感群体中进行验证。AFLP标记R中，L1A29.153、L1A31.135、L1A31.143标记多态率较高，在两个杂交群体中的多态率都在60%以上；AFLP标记S中，L1A25.70、L1A40.80标记多态率较高，在两个杂交群体中的多态率都在60%以上。所有标记在两群体之间的多态率均有统计学差异，p<0.05。综上，本研究首次建立了淡色库蚊溴氰菊酯抗性、敏感品系杂交F2代群体，采用BSA法，筛选到溴氰菊酯抗性性状紧密连锁的AFLP分子标记108个，并分别在F2代溴氰菊酯抗性、敏感群体中进行验证，为建立淡色库蚊溴氰菊酯抗性遗传图谱和数量性状分析（QTL）提供了作图群体和分子标记。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 一、 材料
• （一） 供试蚊
• （二） 主要试剂
• （三） 主要溶液配方
• （四） 主要仪器设备
• 二、 方法
• （一） 淡色库蚊溴氰菊酯抗性、敏感杂交系的建立
• （二） 抗性性状鉴定与检验
• （三） BSA 法筛选遗传标记
• （四） 杂交 F2 群体 AFLP 分子标记多态性鉴定
• 结果
• 一、 淡色库蚊溴氰菊酯抗性、敏感杂交系的建立
• （一） 人工交配试验成功率
• （二） 杂交系和自交系 F1 代生物学特性对比观察
• （三） 杂交系和自交系 F2 代抗性水平检测（幼虫浸渍法）
• 二、 淡色库蚊溴氰菊酯抗性、敏感杂交系的抗性性状鉴定与检验
• （一） 杂交系 F2 群体的抗性性状鉴定
• （二） 杂交系 F2 群体的抗性性状的统计学检验
• 三、 BSA 法筛选与抗药性相关的 AFLP 分子标记
• （一） 单蚊 DNA 质量鉴定
• （二） BSA 法构建淡色库蚊溴氰菊酯抗性、敏感基因池
• （三） AFLP 扩增多态性带型分析
• （四） 抗性、敏感 DNA 池 AFLP 引物多态性分析
• 四、 在杂交系 F2 群体中鉴定 AFLP 分子标记的多态性分析
• （一） AFLP 标记 R 的多态性分析
• （二） AFLP 标记 S 的多态性分析
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢