论文摘要
肝细胞癌（HCC）是我国常见的癌症,位居癌症死亡率第三位。肝癌发生发展是一个多基因、多途径、多阶段的复杂过程,传统治疗方法疗效有限。只有深入了解肝癌生物学分子作用机制并从中寻找肝癌靶向治疗的有效靶点,才能从根本上达到彻底根治肝癌的目的。侵袭、转移性是恶性肿瘤的重要生物学行为特征。大部分肝癌患者因肿瘤转移而丧失了手术的机会,而即使接受手术治疗,术后发生肿瘤转移及复发的几率也非常高。因此,侵袭、转移是影响肝癌患者的预后重要因素之一。次外,化疗,包括经导管动脉栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization, TACE）及靶向药物的治疗,是目前肝癌综合治疗的重要手段,也是提高肝癌患者预后的重要途径之一。然而原发性或继发性化疗耐药的产生已成为制约肝癌化疗疗效的主要瓶颈,且化疗多为非根治性治疗,肝癌化疗后的残存细胞可能发生一些严重的生物学行为改变,甚至有学者认为肝癌化疗后的残留肿瘤细胞,其转移能力、恶性程度均明显升高,从而严重影响肝癌的治疗疗效。因此探索肝癌侵犯、转移及化疗耐药产生的机制并加以有效的干预是肝癌防治中迫在眉睫的事情。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮细胞在正常生理和特定病理情况下向间充质细胞转化的现象,已有的理论表明EMT在调控肿瘤的恶性生物学行为中可能发挥了重要的作用。而Snail、Twist、FOXC1、ZEB1等是调控EMT过程的关键转录因子。为此,本课题组以筛选EMT相关转录因子的差异表达及其功能研究为切入点,深入探讨了EMT与肝癌侵袭转移、化疗耐药的关系。在第一部分内容中,我们首先进行临床资料的筛选,提示FOXC1可能是促进肝癌转移的重要原因,并从体外实验进一步验证了FOXC1在诱导肝癌发生EMT及增强侵袭转移能力中的作用；在第二部分研究中,我们首先用DDP间断化疗+缺氧的方法来处理肝癌细胞,模拟TACE过程、建立体外细胞模型,我们观察到这些细胞发生了EMT现象,并同时获得了一些肿瘤干细胞样特征。其次,我们筛选了DDP+缺氧诱导后的残余细胞中EMT相关转录因子的表达变化,结果发现ZEB1表达异常升高,提示ZEB1在肝癌耐药、耐缺氧形成中可能发挥了重要作用,为此我们进一步研究了ZEB1表达对肝癌细胞耐药、耐缺氧性的影响。最后我们通过研究ZEB1对miR-200c的直接调控作用进一步明确了ZEB1的作用机制。本课题组尝试从EMT相关转录因子的水平来探讨EMT在调控肝癌侵袭转移、化疗耐药等恶性生物学行为中的作用及可能的机制,探讨并丰富了肝癌细胞侵袭转移、化疗耐药产生的理论,为下一步肝癌治疗领域基因药物的开发提供可靠的实验依据。第一部分FOXC1通过调控上皮间质转化促进肝癌侵袭转移性的研究目的：脉管癌栓是肝癌发生侵袭、转移的早期指标之一,其形成机制尚不明确,上皮间质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）是肿瘤发生、转移过程中的重要分子事件,本项目拟通过研究EMT在肝癌血管癌栓形成中的作用来进一步明确EMT对肝癌侵袭、转移能力的影响。方法：选择无脉管癌栓及合并脉管癌栓的肝癌组织标本各15例,realtime RT-PCR方法筛选出差异表达最明显的EMT关键转录因子FOXC1;在组织标本及8种肝癌细胞系中用realtime RT-PCR、Western-blot方法检测FOXC1的表达并分析其临床意义；选择FOXC1高表达的两种肝癌细胞株Bel-7402及SK-Hep1,用shRNA转染的方法敲除FOXC1的表达后,检测上皮及间质表型标记物及snail, slug, twist等转录因子的表达变化；比较FOXC1敲除前后细胞生长速度的差异,并检测细胞凋亡及周期的变化；比较FOXC1敲除前后细胞侵袭、转移能力的变化,并检测了细胞骨架、部分MMPs家族蛋白及VEGF-A的差异表达；选择FOXC1低表达的细胞系Huh7,通过转染的方法过表达snail和twist,或用TGF-β细胞因子处理后检测其FOXC1的表述变化。结果：与无脉管癌栓的组织相比,合并脉管癌栓的肝癌标本中FOXC1表达明显升高（P<0.05）；54%（27/50）配对标本的肝癌组织中FOXC1的表达水平高于癌旁组织,但癌及癌旁组织之间的FOXC1表达差异无统计学意义（P>0.05）,临床病理资料分析进一步发现肝癌组织中FOXC1的表达水平与肿瘤的分化程度、脉管癌栓形成相关（P<0.05）；在Bel-7402及SK-Hepl细胞中敲除FOXC1后,间质表型标记物如vimentin、N-cadherin表达降低,但上皮表型标记物只有部分升高（ZO-1、Claudin-1表达升高,而E-cadherin表达无明显变化）；敲除FOXC1后细胞生长受抑制,流式细胞仪提示细胞发生G0/1期阻止；敲除FOXC1使MMP1、 MMP2、MMP7、MMP9及VEGF-A表达明显降低；敲除FOXC1表达后snail, slug, twist表达无明显差异,而过表达snail和twist,或用TGF-β处理后,FOXC1表达水平明显升高。结论：在合并脉管癌栓的肝癌组织中FOXC1的表达明显升高；抑制FOXC1的表达能部分逆转EMT过程,主要表现为间质表型标记物升高,而上皮表型标记物只有部分降低；敲除FOXC1基因的表达还能降低肿瘤细胞生长速度、下调MMPs、改变细胞骨架、调控VEGF-A的表达,进而发挥抑制肿瘤生长、降低肿瘤侵袭转移能力等功能。第二部分上皮间质转化诱导肝癌细胞化疗耐药性的机制研究目的：经导管动脉栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization、TACE）是治疗中晚期肝癌的主要手段之一,然而TACE在改善患者的长期生存中的作用仍存在较大的争议,甚至有学者认为TACE可能增加部分患者的远处转移几率。TACE是非根治性的治疗手段,经TACE治疗后的残余肝癌细胞发生耐药、耐缺氧及其它生物学改变可能是影响TACE疗效的瓶颈,因此深入研究化疗+缺氧诱导后残余肝癌细胞的生物行为特征具有十分重要的意义。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition, EMT）是目前化疗耐药等恶性肿瘤生物学行为研究中的一个热点。关于EMT与肝癌化疗耐药、耐缺氧的关系目前还没有明确的研究。方法：本实验采用间断顺铂（DDP）+缺氧培养的方法对肝癌细胞BEL-7402及MHCC-LM3进行体外诱导、筛选,根据其母细胞来源将经上述处理后的细胞分别命名为DDP、缺氧诱导的残余细胞（DDP-,hypoxia-induced residue cells, DHR）7402/DHR及LM3/DHR细胞；通过形态学观察及上皮、间质表型标记物检测判断化疗+缺氧能否诱导发生EMT；通过克隆形成、裸鼠体内成瘤试验及检测肿瘤干细胞表面标记物的表达水平判断7402/DHR及LM3/DHR是否具有肿瘤干细胞特性；通过基因敲除的方法研究ZEB1表达对肝癌细胞耐药性的影响；同时,通过病毒转染并建立稳转细胞系,利用realtime RT-PCR等方法研究ZEB1对miR-200c表达的调控作用并通过荧光素酶报告实验来进一步确认；通过western-blot.双荧光素酶报告实验来研究miR-200c对靶基因Bmi-1的直接调控作用。结果：7402/DHR及LM3/DHR形态学上发生了明显变化,包括细胞极性消失,呈梭形或纺锤形；7402/DHR及LM3/DHR表现出一些干细胞特性,包括克隆形成能力增强、裸鼠体内成瘤率增加、肿瘤干细胞相关表面标记物如CD133及CD326表达升高等；EMT相关标记物的检测提示7402/DHR及LM3/DHR发生了EMT,包括上皮表型标记物E-cadherin表达下调,间质表型标记物N-cadherin、Vimentin表达升高等；通过检测调控EMT的关键转录因子,我们发现7402/DHR及LM3/DHR细胞中ZEB1的表达明显水平升高,而敲除ZEB1表达能部分逆转7402/DHR细胞的化疗耐药性,提示ZEB1在肝癌化疗耐药形成中的作用,但敲除ZEB1表达对细胞耐缺氧能力无显著影响。7402/DHR及LM3/DHR细胞中miR-200c及miR-203的表达均明显降低,而转染miR-200c的类似物（mimics）能部分逆转7402/DHR的化疗耐药；Realtime RT-PCR检测提示ZEB1高表达能降低miR-200c的表达水平,而荧光素酶报告实验结果也提示ZEB1能直接抑制miR-200c的启动子活性,提示ZEB1能直接抑制miR-200c的表达；Western-blot及荧光素酶双报告实验提示Bmi-1基因是miR-200c的靶基因。结论：化疗+缺氧能诱导肝癌细胞发生EMT；经化疗+缺氧诱导后的残余肝癌细胞表现出一些肿瘤干细胞的特性；转录因子ZEB1表达升高可能是肝癌细胞获得耐药性的重要原因,但它对细胞耐缺氧能力却无显著影响；miR-200c能直接调控其靶基因Bmi-1的表达,并参与了肝癌细胞化疗耐药形成过程；ZEBl能直接抑制miR-200c的转录,并可能通过抑制miR-200c表达进而调控肝癌化疗耐药。