互花米草富集盐腺细胞转录组测序分析及耐盐相关基因的克隆与鉴定

论文摘要

泌盐盐生植物利用盐腺能将体内过多的盐分排出体外,有效降低体内盐浓度,从而适应盐渍环境产生的盐胁迫,盐腺是泌盐盐生植物适应盐渍环境特化的结构。对盐腺泌盐生理过程研究表明,高盐胁迫条件下,盐腺能以高速率将进入体内的Na+排出体外;盐腺结构及高效的离子运输功能可能与盐腺内特殊基因的表达和调控机制相关,因此,对植物盐腺的研究有助于发掘与盐腺发育及离子高效运输相关的基因,阐明其分子调控机制。盐腺内包含大量与泌盐相关的信息,转录组分析可在整体水平上研究细胞中基因转录表达的时空信息及转录调控规律,是研究生物（组织）的生命过程中基因表达调控分子机理的有效手段。在盐胁迫条件下,构建的互花米草盐诱导cDNA文库中,许多耐盐相关的EST序列丰度和种类都存在明显差异;对文库中许多序列进行分析表明,其表达模式同该植物的盐腺泌盐活动存在某些联系。但是,要更加精确而全面地研究盐腺细胞泌盐相关遗传机理,特别是要了解调控盐腺细胞离子高效转运的基因的表达调控机制,有必要对盐腺细胞的基因表达调控进行研究分析,获得与盐腺细胞基因组成及表达调控相关的遗传学信息。近年来,激光捕获显微切割（LCM）技术的应用促进了特定细胞类型基因表达谱的研究,在植物细胞基因表达谱研究中也取得了成功。本课题利用激光捕获显微切割（LCM）技术,以泌盐盐生植物互花米草为材料,通过富集盐腺细胞对盐诱导条件下盐腺细胞进行特异的转录组分析,进一步研究盐腺细胞中参与离子转运、囊泡运输相关基因的表达特点,探索它们在盐腺泌盐过程中的作用。过表达囊泡运输相关基因VAMP,对转基因植株的初步分析表明,该基因可能通过调节与葡萄糖转运的相关过程参与盐胁迫应答:实验得到纯合的转基因株系,在盐胁迫和葡萄糖胁迫的情况下表现出一定敏感性和耐受性,说明SaVAMP基因在胁迫条件下,调控植物的抗逆境反应。创新点:1、本课题首次尝试利用LCM技术精确捕获分离互花米草盐腺细胞,通过转录组测序与基因表达谱分析,研究其泌盐及耐盐相关基因表达和分子机制。2、对富集盐腺细胞技术条件进行优化,如石蜡切片技术、扫描电镜技术、激光显微切割技术实验条件的优化,用于观察细胞形态和分布特点。3、对盐腺细胞富集和RNA提取方法和流程进行优化与探索,包括高质量RNA提取方法、材料的予处理过程的优化设计。4、本课题首次尝试对泌盐植物盐腺类细胞进行转录组测序与基因表达谱分析,并在分子水平上研究盐腺泌盐相关基因的表达、调控的分子遗传机理,探索与盐腺泌盐相关的离子高效运输机制。5、首次克隆了互花米草囊泡运输相关的SaVAMP基因,并通过在拟南芥中进行异源过量表达对其功能进行初步分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 高盐对植物的影响
• 1.1.1 盐分对植物的伤害
• 1.1.1.1 生物膜破坏
• 1.1.1.2 产生活性氧
• 1.1.1.3 胁迫对抗氧化物酶和抗氧化物的影响
• 1.1.2 植物耐盐机理
• 1.1.2.1 植物拒盐和对离子的选择性吸收
• 1.1.2.2 植物通过离子区隔化酶类使离子区隔化提高盐胁迫耐受性
• 1.2 盐腺简介
• 1.3 泌盐盐生植物互花米草
• 1.4 激光显微切割技术
• 1.4.1 激光显微切割技术的发展
• 1.4.2 激光捕获显微切割技术的原理
• 1.4.3 激光捕获显微切割技术的应用
• 1.4.3.1 激光捕获显微切割技术在植物中的应用
• 1.4.3.2 激光捕获显微切割技术在其他领域的应用
• 1.4.4 激光捕获显微切割技术的优点
• 1.5 转录组测序及基因表达谱分析
• 1.5.1 cDNA 文库
• 1.5.2 EST 序列分析的研究现状
• 1.5.3 转录组测序及功能分析
• 1.6 囊泡运输相关基因VAMP
• 1.6.1 SNAREs 介导膜融合的过程
• 1.6.2 VAMP 研究进展
• 2 实验论文
• 2.1 互花米草富集盐腺细胞转录组测序分析及基因表达谱分析相关实验
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 化学试剂
• 2.1.1.3 仪器设备
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 互花米草石蜡切片的制作步骤及方法
• 2.1.2.2 扫面电镜观察盐腺结构的步骤及方法
• 2.1.2.3 激光显微切割技术富集盐腺及转录组测序
• 2.1.3 实验结果及分析
• 2.1.3.1 互花米草石蜡切片
• 2.1.3.2 扫面电镜观察盐腺结构
• 2.1.3.3 激光显微切割技术富集盐腺
• 2.1.3.4 富集互花米草盐腺细胞RNA 提取及转录组测序结果
• 2.1.4 结论与讨论
• 2.1.4.1 互花米草石蜡切片制作分析
• 2.1.4.2 激光显微切割的技术难点分析
• 2.1.4.3 互花米草盐腺富集及转录组测序分析
• 2.2 囊泡运输相关基因VAMP 的载体构建和功能鉴定
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 植物材料
• 2.2.1.2 菌种及质粒
• 2.2.1.3 培养基
• 2.2.1.4 化学试剂
• 2.2.1.5 仪器设备
• 2.2.1.6 相关分析软件
• 2.2.1.7 引物
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 互花米草总RNA 的提取
• 2.2.2.2 互花米草VAMP 基因的克隆
• 2.2.2.3 GeneClean 方法从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段
• 2.2.2.4 加尾操作
• 2.2.2.5 PCR 产物与pMD18-T 载体的连接
• 2.2.2.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化
• 2.2.2.7 质粒提取及酶切验证
• 2.2.2.8 T 载体插入序列的测序与序列分析
• 2.2.2.9 植物表达载体的构建与农杆菌的转化
• 2.2.2.10 质粒酶切鉴定转化菌株
• 2.2.2.11 渗透法转化拟南芥
• 2.2.2.13 不同浓度NaCl 胁迫下转基因SaVAMP 拟南芥萌发生长状况测定
• 2.2.2.14 转基因SaVAMP 拟南芥对外源甘露醇和LiCl 的响应
• 2.2.2.15 转SaVAMP 基因拟南芥对ABA 的响应
• 2.2.2.16 转SaVAMP 基因拟南芥对外源葡萄糖的响应
• 2.2.3 实验结果及分析
• 2.2.3.1 RNA 提取结果
• 2.2.3.2 互花米草cDNA-PCR 结果琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.3.3 提取的质粒酶切图片
• 2.2.3.4 互花米草VAMP 克隆结果与分析
• 2.2.3.5 连入载体后的质粒双酶切鉴定
• 2.2.3.6 转入GV3101 后的质粒双酶切鉴定
• 2.2.3.7 盐处理和未盐处理互花米草不同组织SaVAMP 基因的表达情况
• 2.2.3.8 SaVAMP 过表达转化子的筛选
• 2.2.3.9 转SaVAMP 基因拟南芥的PCR 鉴定
• 2.2.3.10 转SaVAMP 基因拟南芥的耐盐性变化
• 2.2.3.11 转SaVAMP 基因拟南芥对外源甘露醇和LiCl 的响应结果
• 2.2.3.12 转SaVAMP 基因拟南芥对外源ABA 的响应结果
• 2.2.3.13 转SaVAMP 基因拟南芥对外源葡萄糖的响应结果
• 2.2.4 结论与讨论
• 2.2.4.1 互花米草VAMP 基因的表达情况分析
• 2.2.4.2 转SaVAMP 基因拟南芥的耐盐性分析
• 2.2.4.3 转SaVAMP 基因拟南芥对外源甘露醇和LiCl 的响应结果分析
• 2.2.4.4 转SaVAMP 基因拟南芥对外源ABA 的响应结果分析
• 2.2.4.5 转SaVAMP 基因拟南芥对外源葡萄糖的响应结果分析
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 攻读学位期间发表的论文目录