玉米非编码RNA在非生物胁迫下的表达研究

论文摘要

近年来,随着人类和多种模式生物基因组测序工作的完成,人们发现非编码蛋白基因的数量远远超过编码蛋白基因数量,且越高等的生物,不编码蛋白质的部分在其基因组中所占的比例越大。不编码蛋白的RNA分子即为非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）,随着测序技术的进步,大量新的非编码RNA被鉴定出来,但对其功能的研究却进展缓慢。ncRNA在生命活动中发挥着非常重要的作用,如参与染色质结构的修饰,蛋白质合成,RNA的转录和转录后加工修饰等。因此,对ncRNA的功能研究越来越受到人们的重视。植物在主动应对逆境的过程中,主要涉及形态、生理生化和分子水平上的适应性变化,目前对植物响应逆境胁迫机制的认识大多是从编码蛋白的基因阐述的,在非编码RNA的报道大都集中在miRNA方面。本实验以玉米为研究材料,在实验室前期鉴定了一批新ncRNA的基础上,选取其中11个100bp左右的ncRNA,对3叶期的玉米实施一定的逆境处理,用PEG6000和ABA模拟干旱胁迫,用高浓度的NaCl模拟盐胁迫,选择对胁迫敏感的组织-根作为研究对象,利用前人研究结果中得到的胁迫响应基因DREB2A,dbf1,dhn1来确定胁迫的具体作用时间。通过半定量RT-PCR及Northern杂交研究这些ncRNA在胁迫处理下的表达情况,初步探究中等长度片段ncRNA参与植物逆境响应的调控机制,为玉米转基因改良提供一定的理论依据。主要研究结果如下:1.选取的响应基因在三种处理下的半定量RT-PCR结果表明,在PEG6000浓度为20%,处理时间为1 h时,干旱响应基因dbf1开始大量表达;在ABA浓度为100μmol·L-1,处理时间为3 h时,ABA模拟干旱诱导基因dhn1开始大量表达;在150 mmol·L-1 NaCl处理3 h后,盐胁迫响应基因DREB2A表达量开始上升。2.通过半定量RT-PCR和Northern杂交发现,选取的11个ncRNA对三种处理都有响应,但响应程度有所不同。对PEG处理来说,ncRNA能够产生快速响应,被诱导表达的ncRNA多在1小时时表达量已经达到最高,对ABA处理来说,ncRNA被逐渐诱导表达,在6小时时达到最高,对盐处理来说,ncRNA多在3小时时出现表达高峰。另外不同ncRNA对不同胁迫的响应方式也不同,在施加PEG或ABA处理的短时间内,Zm-17、Zm-28、Zm-60、Zm-88都被快速诱导大量表达,Zm-128、Zm-89、Zm-79、Zm-29在PEG处理后表达量逐步下降,而在ABA处理后,Zm-128、Zm-89、Zm-79、Zm-29在短时间内被诱导表达,至6小时表达量达到最高,随后逐渐下降至正常水平,说明这四个ncRNA在PEG处理后转录受抑制,但在ABA处理后短时间内有被诱导表达的趋势。Zm-37在PEG处理后表达量呈直线下降趋势,但在ABA处理后首先被诱导表达,然后逐步降至正常水平,该趋势同样出现在NaCl处理后。我们同时比较了三种胁迫处理后这11个ncRNA的表达情况发现,ABA处理和NaCl处理后单个ncRNA表现出的表达趋势更趋于一致,而与PEG处理后ncRNA的表达趋势有较大差别。表明这些ncRNA在盐胁迫条件下参与玉米根的胁迫应答反应时可能是通过依赖于ABA的信号转导途径发挥作用的。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物逆境与抗逆反应
• 1.1.1 植物遭遇逆境种类
• 1.1.1.1 水分胁迫
• 1.1.1.2 干旱胁迫
• 1.1.1.3 盐胁迫
• 1.2 植物逆境的分子生物学研究进展
• 1.2.1 植物逆境的信号传导与调控因子
• 1.2.1.1 顺式调控元件
• 1.2.1.2 反式作用因子
• 1.3 非编码RNA 介绍
• 1.3.1 ncRNA 的分类及研究情况
• 1.3.2 ncRNA 研究技术进展
• 1.3.2.1 鉴定ncRNA 的技术
• 1.3.2.2 ncRNA 功能研究方法
• 1.4 植物中部分重要ncRNA
• 1.5 ncRNA 在植物发育中的调控作用
• 1.6 非编码RNA 在调控植物环境适应性中的作用
• 1.7 植物ncRNA 的调节途径
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 供试材料
• 3.1.2 实验仪器、耗材
• 3.1.3 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 试验制备
• 3.2.1.1 预备耗材处理方法
• 3.2.1.2 部分试剂的配制方法
• 3.2.2 玉米水培体系的建立
• 3.2.2.1 水培体系的配置方法
• 3.2.2.2 玉米水培及取样方法
• 3.2.3 玉米三种胁迫响应基因的表达分析
• 3.2.3.1 三种胁迫响应基因的确定
• 3.2.3.2 不同胁迫处理玉米根总RNA 提取
• 3.2.3.3 玉米根cDNA 的合成方法
• 3.2.3.4 PCR 的反应体系及程序
• 3.2.3.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.4 玉米11 个ncRNA 在三种逆境胁迫下的表达分析
• 3.2.4.1 已知的11 个ncRNA 相关信息
• 3.2.4.2 11 个玉米ncRNA 的引物设计
• 3.2.4.3 总RNA 加3AD 接头
• 3.2.4.4 ncRNA cDNA 合成
• 3.2.4.5 PCR 反应体系及程序
• 3.2.4.6 ncRNA PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.5 Northern 杂交验证
• 3.2.5.1. 制备探针
• 3.2.5.2 Northern blot
• 4 结果与分析
• 4.1 玉米三种处理响应基因的RT-PCR
• 4.1.2 玉米样品总RNA 提取结果
• 4.1.3 玉米三种处理响应基因的RT-PCR 结果
• 4.2 11 个玉米ncRNA 在胁迫下的RT-PCR 结果与分析
• 4.2.1 总RNA 加3AD 接头结果
• 4.2.2 ncRNA RT-PCR 结果与分析
• 4.2.2.1 11 个ncRNA 在PEG 处理后的表达情况
• 4.2.2.2 11 个ncRNA 在ABA 处理后的表达情况
• 4.2.2.3 11 个ncRNA 在NaCl 处理后的表达情况
• 4.3 Northern 杂交验证
• 4.3.1 探针制备结果
• 4.3.2 ncRNA Zm-128 与Zm-60 在3 种处理下的表达
• 4.3.2.1 ncRNA Zm-128 在3 种处理下的表达
• 4.3.2.2 ncRNA Zm-60 在 3 中处理下的表达
• 5 结论与讨论
• 5.1 有效的胁迫处理条件
• 5.2 ncRNA 对不同逆境胁迫的响应速度不同
• 5.3 不同ncRNA 对不同胁迫的响应方式不同
• 5.4 ABA 处理与NaCl 处理下单个ncRNA 的表达趋势更趋一致
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表论文
• ABSTRACT