论文摘要
研究背景和目的心房纤颤（房颤）是一种最常见的心律失常,由于其可以造成心排量减少、心室率过快过慢,可加重心肌缺血及恶化心功能,并且可引起左房血栓形成和全身栓塞并发症（其中脑栓塞形成发病率高）,极大地威胁人民健康,造成了巨大的社会经济负担。近年来,有关于房颤的多种治疗方法取得了巨大进步,特别是房颤射频消融治疗取得了明显进展,但是对房颤的发病机制,对引起房颤电解剖重构和引起房颤高凝的具体原因和机理等问题,仍没有非常明确的认识,这也是造成目前房颤及其并发症预防治疗效果不尽如人意的主要原因。最先引起人们认识到房颤与炎症相关的例子是心外科手术后同时出现的高炎症水平状态和高房颤发病率,目前越来越多的研究证据表明房颤与炎症密切相关,而炎症状态不依赖于引起房颤的基础心脏病和其他可能引起炎症的非房颤状态。这些研究证据包括房颤个体心房组织炎症细胞浸润增多、炎症因子表达增多,包括炎症患者血液炎症标记物水平显著增高,包括使用有抗炎作用多效性药物（如他汀类药物、ACEI/ARB类药物和鱼油等）以及糖皮质激素等治疗显著减少房颤发病的证据。也有一些研究得到不同的结果,尤其是有关房颤和炎症关系的研究绝大多数是横断面研究,只能说明两者是一种共存关系,而不能说明炎症究竟是不是引起房颤的病因,因此房颤就是一种炎症性疾病这种观点目前还不像“动脉硬化实质上是一种炎症性疾病”那么广为接受。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）由单核细胞和巨噬细胞产生,同时它也是单核细胞和巨噬细胞的最强的旁分泌激活剂,单核细胞受到激活后可产生一系列的细胞因子,其中就包括白介素-6（IL-6）,IL-6又可刺激肝脏产生急性期反应物C-反应蛋白（CR-P）。CRP是公认的一系列炎性疾病的标记物。大规模临床研究显示,动脉粥样硬化斑块可发现有相当数量的TNF-α和CRP,这与心血管危险事件的发生是显著相关的。迄今为止,不少研究已经对CRP与房颤的关系进行了研究,但是极少有关房颤的研究关注TNF-α。TNF-α基因启动子区的一些SNPs已经被发现与循环TNF-α水平显著相关,并且研究还发现一些炎症性疾病,如慢性阻塞性肺病和冠心病,这些SNPs位点基因型分布与健康人有显著性差异或不同SNPs位点的基因型预示不同患这些炎性疾病的风险。然而,据我们所知,目前尚没有研究对TNF-α基因多态性,尤其是其启动子区SNPs现象和房颤的关系进行探讨。血栓性静脉炎和脓毒血症时血液处于高凝状态是炎症引起高凝状态的典型例子,事实上,心脑血管硬化和心衰的研究有非常多的证据表明,炎症水平是决定血栓性事件发生的重要原因之一。虽然房颤时高凝状态和血小板功能激活是非常明确的,是造成房颤血栓形成的重要原因之一（其他两个原因包括心房血流淤滞和内皮功能损害）,但是房颤高凝状态和血小板功能激活与炎症水平的关系,尽管对指导采取何种预防血栓形成的治疗策略意义很大,目前已有的研究较少涉及这方面,国内外几乎没有相关的研究报告。还有房颤时凝血功能和血小板功能的激活是由房颤本身所引起,还是由房颤合并的基础心脏病所引起,目前尚存在有较大争议。而关于特发性房颤、特别是孤立性房颤的内皮功能、凝血功能和血小板功能变化,目前还未见系统的研究,同时关于它们的抗栓治疗问题,2006ACC/AHA/ESC房颤指南的推荐还有不尽明确的地方。心房纤颤（房颤）时可出现明显的心房形态学改变、如心房扩大和二尖瓣关闭不全有关房颤时左心房结构和功能变化的研究报告较多,但关注房颤时右心房改变的研究相对较少。目前关注房颤心房扩大发生机制的研究非常少。而炎症是促进组织坏死的因素之一。例如动实验结果表明,过度表达TNF-α可导致动物出现心肌炎、心肌细胞坏死、心肌纤维化、收缩功能障碍、心肌肥厚和心室扩张等变化,并使其死亡率增高。本研究的主要目的包括:中国人TNF-α启动子区SNPs位点基因型的分布特点,研究房颤发病是否伴发明显的炎症标记物的变化,研究决定炎症上游因子TNF-α表达效率的基因启动子区各SNP位点不同基因型在房颤患者与非房颤对照个体分布情况是否不同,研究房颤发病的预测因子、尤其是不同基因型是否预示房颤发病风险高低;研究房颤本身是否伴发高凝状态和血小板激活,研究高凝状态和血小板激活可能的影响因素,尤其是炎症因素在这个过程起何种作用;研究特发性房颤和孤立性房颤内皮功能、凝血功能和血小板功能的变化特点及对抗栓治疗方案的指导;研究房颤患者本身引起的心脏、特别使双心房形态学改变及其与炎症因素的相互关系。研究方法入选房颤患者102例（作为研究组）和性别、年龄和危险因素匹配的对照组个体117例。房颤通过心电图或入院诊断进行确认。排除标准包括:高龄,合并明显动脉硬化性疾病,先心病、风心病、心肌病、左室肥厚和心功能不全、等器质性心脏病,糖尿病,慢性炎症性疾病,结缔组织疾病,60天内手术史和急危重症,肿瘤和重要器官功能衰竭。详细记录患者病史（尤其是房颤发病时间和特点）、体检情况(重点进行血压测定、心脏体检（包括心率、节律和脉率等各项和身高、体重、腹围等）、临床检验（常规化验、血生化指标、血凝血指标和炎症指标等）和临床检查结果（常规胸片、心电图和心脏超声等检查结果）。血脂、血糖、血肝肾功能等指标采用酶法测定,血纤维蛋白原（Fib）、部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血时间等采用酶法测定,血电解质测定采用电解质分析仪直接电极法、血CRP测定采用免疫浊度法、甲状腺功能测定采用放射免疫法。心脏超声检查常规测量包含以下指标:左房前后径（LAd）、右房上下径（RAd）、室间隔收缩期厚度（IVSd）、二尖瓣返流程度（MR）和左室射血分数（LVEF）。患者组进行射频消融治疗者在术前72小时进行经食道心脏超声检查。留取研究对象的全血和血清标本,部分标本用于临床送检,全血标本用于基因组DNA提取,血清冷冻于-70℃低温冰箱整批用于TNF-α、P-Selectin和vWF等细胞因子的检测。全血基因组DNA提取采用德国QIAGEN全血DNA小量提取试剂盒(QIAamp?DNA Blood Mini Kits)提取,主要步骤包括细胞裂解、过柱吸附、杂质洗涤和DNA洗脱。采用琼脂糖凝胶电泳方法确定DNA质量,并采用光密度比对法确定其浓度。使用Prime Premier5软件设计TNF-α启动子区目的片段引物,并交公司进行合成。采用PCR方法(美国Promega PCR扩增试剂盒GoTaq?PCR CoreSystemsⅠ)扩增基因组DNA的TNF-α启动子区目的片段,主要步骤包括变性、退火和延伸,并反复进行多个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并与DNAmarker进行比对,确认片段长度约为808bp。产物送公司进行专业纯化和核酸测序。测序结果使用Chromas软件进行读图,使用Pubmed网站Blast功能进行比对,确定每个个体基因型,尤其是各SNP位点的基因型。血清细胞因子检测采用免疫酶联吸附分析方法（ELISA）检测,其中血清TNF-α检测采用美国R&D公司TNF-αELISA检测试剂盒（Human TNF-α/TNFSF1AImmunoassay Kit）,可溶性P-选择素（sP-Selectin）检测采用武汉博士德公司P-Selectin检测试剂盒（Human P-Selectin ELISA Kit）,血管病性假血友病因子（vWF）检测采用上海太阳生物技术有限公司血管性血友病因子（vWF）含量测定试剂盒。主要步骤包括:结合抗原（样本）、结合酶标抗体、洗涤、加底物显色、终止反应并在酶标仪上进行光密度读数。使用软件Curve Expert 1.3对各指标进行标准曲线制作和标本光密度读数-浓度转换。统计学分析采用SPSS13.0软件进行,计量资料行正态性检验,正态性检验采用单样本K-S拟和优度检验（1-Sample K-S Test）。如符合正态分布,数据用x-±S表示;如不符合正态分布,数据用中位数（median）（四分位数间距,IQR）表示。对于显著偏态分布的资料,进行对数转换后再进入协方差和回归分析。两组正态分布的计量资料均数比较采用Student t检验,两组中有一组以上是非正态分布的计量资料均数比较采用Mann-Whitney U检验。两组计量资料均数比较同时要控制其他对应变量有影响的因素时采用协方差分析,将可能有影响的因素作为协变量。计数资料表示为率,两个率的比较采用卡方检验（Fisher’s ExactTest）。两组正态分布资料相关分析采用Pearson相关;对于非双变量正态分布资料的相关分析,采用Spearman相关。两变量相关分析同时控制其他因素对这种相关关系的影响时采用偏相关分析,将其他因素作为控制变量。房颤独立预测因子估计采用logistic回归分析,房颤分组作为应变量,其他房颤组与对照组比较差异显著性P＜0.20的变量以及性别、年龄等一般情况纳入作为自变量。-308G/A不同基因型房颤风险推测采用卡方检验的“risk estimate”。重要的研究指标（包括炎症促凝指标Fibrinogen和sP-Selectin）的影响因素估计采用多元回归分析,将这些指标分别作为应变量,将性别、年龄、分组及单因素相关分析中分别与这些应变量相关关系显著性P＜0.20的计量变量和不同分组应变量指标差异显著性P＜0.20的分类变量作为自变量。研究结果房颤组女性40例,男性62例（60.8%）;对照组79例患者有性别记录,其中女性31例,男性48例（60.8%）,两组性别比例相比无显著性差异（P＞0.05）。房颤组年龄为56.7±10.9岁,对照组年龄为55.2±9.2岁,两组年龄相比无显著性差异（P＞0.05）。房颤组包括阵发性房颤87例,持续性房颤6例,长期持续性房颤9例。对照组包括房室结折返性室上性心动过速患者30例、窦性心律个体49例、健康人DNA样本38例。房颤组特发性房颤为61例,合并高血压患者为41例（40.1%）;对照组健康人+房室结折返性室上性心动过速患者72例,单纯性高血压者为45例（38.5%）,两组高血压合并率相比无显著性差异（P＞0.05）。TNF-α启动子区检测片段内-851、-575、-419和-244四个SNP位点未检测到少见基因型（或少见碱基）。房颤组和对照组之间-863、-857、-806、-782、-646、-572、-570、-376G/A和-238等各位点基因型分布均无显著性差异（P＞0.05）,这些位点少见基因型的总频率分别为24.9%、24.4%、7.2%、1.0%、1.9%、2.4%、1.0%、0.5%和2.4%。房颤组-308non-GG和-308GG分布频率分别为21%和79%,其中有1例是-308AA携带者,对照组-308GA和-308GG分布频率分别为10.1%和89.9%,未发现-308AA携带者,两个构成比相比有显著性差异（P=0.035）。-308non-GG与-308GG患房颤优势比（OR）为2.368（95%CI为1.078-5.205）。提示房颤患者-308位点基因型分布与对照组相比有显著性差异,房颤患者少见基因型-308non-GG携带率更高,并且-308non-GG提示更高的患房颤风险。房颤组和对照组的各项血液指标相比显示房颤组和对照组血TNF-α（pg/ml）的浓度分别为3.84（3.07,4.49）和2.85（2.28,3.60）,相比有显著性差异（P＜0.001）;血CRP水平分别为（mg/L）1.70（1,3.12）和1.00（0.95,2.10）,相比有显著性差异（P=0.015）;血Fib（g/L）水平分别为3.03（2.62,3.65）和2.58（2.28,3.02）,相比有显著性差异（P=0.002）;sP-Selectin（ng/ml）水平分别为26.5±5.8和21.3±3.8,相比有显著性差异（P＜0.001）;血GPT（U/L）水平分别为22.50（17.00,29.50）和18.00（13.50,23.50）,相比有显著性差异（P=0.002）。房颤组和对照组vWF（%）水平分别为107.31（90.30,128.58）和81.57（71.12,101.25）,相比无显著性差异（P=0.372）。其余血常规、血糖、血脂、肝肾功能、血电解质、甲状腺功能等血液指标房颤组和对照组相比均未见显著性差异（P＞0.05）。提示房颤患者比对照组有明显的炎症水平增高、血小板功能激活和凝血激活。阵发性房颤患者和对照组血Fib水平分别为3.20±0.84和2.77±0.60 g/L（P=0.005）,阵发性房颤患者和对照组血血sP-selectin水平分别为26.2±5.9和21.5±3.9 ng/mL（P＜0.001）。协方差仍然提示阵发性房颤Fib和sP-selectin水平分别较对照组显著增高。房颤组和对照组心动过缓发生率分别为29.7%和6.8%,相比有显著性差异（P＜0.001）。房颤组和对照组患者二尖瓣返流（MR）的发生率分别为52.3%和14.9%,相比有显著性差异（P＜0.001）。房颤组和对照组LAD（mm）分别为33.0（35.0,38.0）和28.0（30.0,33.0）,相比有显著性差异（P＜0.001）;RAD（mm）分别为47.0（43.0,51.0）和41.0（37.0,43.0）,相比有显著性差异（P＜0.001）;IVSD（mm）分别为10.6（10.3,10.8）和9.6（9.2,9.9）,相比有显著性差异（P＜0.001）。提示房颤心动过缓发生率增高和心脏形态学改变更明显。-308GG与-308non-GG个体血TNF-α浓度分别为3.37（2.72,4.44）和3.36（2.83,4.16）,两者相比无显著性差异（P=0.600）。Logistic回归分析显示,TNF-α、sP-selectin和LAd均是房颤的独立预测因子,其OR值分别为1.375（95%CI:1.024-1.846,P=0.035）、1.248（95%CI:1.121-1.389,P＜0.001）和1.321（95%CI:1.125-1.552,P=0.001）。炎症因素（TNF-α或CRP）与促凝血因素（sP-Selectin或Fib）之间均有显著的正相关关系,尤其是CRP与Fib之间的相关系数为0.560（P＜0.001）。以年龄、性别和分组（是否房颤）作为控制变量的偏相关分析显示TNF-α与Fib、TNF-α与sP-Selectin以及CRP与sP-Selectin三对相关没有统计学意义,CRP与Fib之间相关仍较密切且具显著性（r=0.421,P＜0.001）,控制变量分组（是否房颤）的作用在各对关系中均有统计学意义。多元回归分析表明,分组（是否房颤）、sex、age和lgCRP的标准回归系数分别为0.302（P=0.004）、-0.396（P＜0.001）、0.221（P=0.032）和0.265（P=0.013）,显示对血浆Fib水平均有显著性影响,房颤、女性、高龄和高炎症水平提示高血Fib水平。多元回归分析表明,分组因素（是否房颤）标准回归系数为0.446（P＜0.001）,显示对血清sP-Selectin水平有显著性影响。亚组分析结果表明,特发性房颤患者和未合并高血压的对照组个体分别为61例和34例（其中房室结折返性阵发性室上速18例,健康个体16例）,两组之间性别比例、年龄、血细胞计数、血生化指标水平、血电解质水平和血小板计数等相比均无显著性差异,两组间血vWF水平无显著性差异,而两组血清sP-selectin水平分别为25.97±6.17 ng/mL和22.08±4.72 ng/mL（P=0.005）,血浆Fib水平分别为3.19±0.97 g/L和2.74±0.57 g/L（P=0.031）。说明与对照相比,特发性房颤患者有明显的高凝状态和血小板激活。特发性房颤中49例阵发性房颤患者血sP-selectin和Fib水平分别为25.50±6.35ng/mL和3.15±0.70g/L,显著高于对照组患者（P值分别为0.018和0.015）。亚组分析结果表明,孤立性房颤患者和＜60岁未合并高血压的对照组个体分别为38例和21例（其中房室结折返性阵发性室上速14例,健康个体7例）,两组之间性别比例、年龄、血细胞计数、血生化指标水平、血电解质水平和血小板计数等相比均无显著性差异,两组间血清vWF和血浆Fib水平无显著性差异,而两组血清sP-selectin水平分别为26.80±6.28ng/mL和22.51±4.97 ng/mL（P=0.009）。提示孤立性房颤患者有显著的血小板激活。方差分析显示,对照组、阵发性房颤和持续性房颤LAd值分别为30.6±3.8,35.1±4.0和43.4±7.1mm,方差分析显示三组间LAd值有显著性差异,两两比较显示阵发性房颤和持续性患者LAd值分别与对照组相比有显著性差异（P值均＜0.001）,持续性房颤与阵发性房颤有显著性差异（P=0.005）。方差分析显示,对照组、阵发性房颤和持续性房颤RAD值分别为42.8±4.8,46.2±6.2和55.8±7.0mm,方差分析显示三组间LAD值有显著性差异,两两比较显示阵发性房颤和持续性患者RAD值分别与对照组相比有显著性差异（P=0.001和P＜0.001）,持续性房颤与阵发性房颤有显著性差异（P=0.001）。提示与窦性心律相比,房颤可出现显著的心房形态学改变,持续性房颤心房形态学改变显著重于阵发性房颤。本研究未发现持续性房颤持续时间对心脏形态学改变有显著影响,考虑可能原因是入选的这两类患者例数太少。单因素分析显示,LAD与RAD显著密切相关（r=0.567,P＜0.001）。提示房颤时左右心房解剖重构是同步的。房颤患者CRP水平与LAd偏相关分析（控制性别、年龄、有无高血压和有/无二尖瓣关闭不全）结果显示,偏相关系数r=0.254,P=0.078;房颤患者CRP水平与RAd偏相关分析（控制性别、年龄、有无高血压和有/无二尖瓣关闭不全）结果显示,偏相关系数r=0.255,P=0.078。提示CRP水平与LAd和RAd的相关性均未达到统计学意义。研究结论1.本研究未发现研究人群在-851、-575、-419和-244四个SNPs位点出现少见碱基。2.首次发现房颤患者在TNF-α启动子区-308位点少见基因型携带率显著增高,并首次证实-308A携带者预示患房颤风险更高,提示TNF-α基因多态性影响房颤的易患性,支持炎症因素作为房颤发病的病因之一。3.发现炎症标记物TNF-α、血小板功能标记物sP-selectin和左房大小标志LAd为房颤发生的独立预测因子,支持炎症因素在房颤的发病过程起作用。4.证实房颤时存在凝血功能激活。血Fib水平的显著影响因素包括房颤发生率、性别、年龄和炎症因素。房颤、女性、高龄和高炎症水平提示高血Fib水平。首次发现炎症因素对房颤患者凝血指标有显著性影响。5.证实房颤时存在血小板功能激活,未发现炎症因素对其有显著性影响。6.证实阵发性房颤发作间歇期有明显的高凝状态和血小板激活。7.特发性房颤患者凝血功能和血小板功能激活,孤立性房颤患者凝血功能无明显激活,但血小板功能显著激活。提示房颤可独立引起凝血和血小板功能激活。8.房颤时左右房直径均显著增大,首次专门对房颤右房的形态学变化做了研究,未发现炎症因素对房颤心房重构过程有显著性影响。9.持续性房颤炎症标记物水平增高和心房直径扩大的程度超过阵发性房颤,提示房颤负荷越大、炎症激活和心房扩大越严重。
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