大豆血红蛋白基因转化根瘤菌工程菌株的构建

论文摘要

大豆根瘤内的血红蛋白是一类与固氮作用密切相关的共生植物血红蛋白,它包括4个主要组分,即]Lba、Lbc1、Lbc2、Lbc3。四个大豆血红蛋白分别由四个相对应的基因（lba、lbc1、lbc2、lbc3）编码,并且这些基因在大豆植株中为“隐性基因”,只有在根瘤菌侵入大豆根系后,才在根部特异表达。根瘤中大豆血红蛋白的含量与固氮酶活性呈正相关性,因此,只有在大豆血红蛋白存在的前提下,根瘤才能够正常的进行固氮作用,才能为宿主植物源源不断的提供生长所需的氮源。本研究通过分子生物学和基因工程手段,将大豆血红蛋白基因导入根瘤菌内,构建出能够自身合成大豆血红蛋白的根瘤菌工程菌株,从而确保固氮作用正常进行,增强根瘤的固氮效率,为大豆植株提供充足的氮源。同时,为进一步对根瘤菌与非豆科植物共生固氮作用的研究奠定实验基础。本研究提取大豆根瘤总RNA并将其反转录成cDNA,以其为模板,采用同源序列克隆法,利用PCR技术得到四个大豆血红蛋白基因lba、lbc1、lbc2、lbc3的编码区序列,生物信息学分析表明,所克隆的基因与已报道的血红蛋白基因相似性达到100%,可以确定所扩增的片段为大豆血红蛋白基因。利用DNA重组技术,将四个大豆血红蛋白基因（lba、lac1、lbc2、lbc3）和串联基因簇（lbc3-lbc2-lbc1-lba,命名为lbX）分别连接到lac启动子的下游,获得目的片段Plac-lba、Plac-lbc1、Plac-lbc2、 Plac-lbc3、Plac-IbX,并将目的片段分别连入带有luxAB标记基因的质粒载体pTR102中,成功构建了5个原核表达载体pTR-Plac-lba、pTR-Plac-lbc1、pTR-Plac-lbc2、 pTR-Plac-lbc3、pTR-Plac-lbX。利用三亲本杂交的方法,将构建的原核表达载体分别转化快生型大豆根瘤菌15067（用SF表示）和土著大豆根瘤菌（用SFH表示）,成功构建出10株转基因工程菌株：SF （pTR-Plac-lba）、SF （pTR-Plac-lbc1）、SF （pTR-Plac-lbc2）、SF （pTR-Plac-lbc3）、SF （pTR-Plac-lbX）和SFH （pTR-Plac-lba）、 SFH （pTR-Plac-lb1）、SFH （pTR-Plac-lbc2）、SFH （pTR-Plac-lbc3）、SFH （pTR-Plac-lbX）。质粒的遗传稳定性检测结果表明：自生条件下,重组质粒pTR-Plac-lba、 pTR-Plac-lbc2、pTR-Plac-lbc3、pTR-Plac-lbX的遗传保持率均为100%；共生条件下,接种转基因工程菌的供试大豆根瘤发光活性检测结果均为100%,5种重组载体在快生型大豆根瘤菌15067和土著大豆根瘤菌中均能稳定遗传。大豆盆栽实验结果表明：与作为对照的接种快生型大豆根瘤菌15067的大豆植株相比,接种转基因工程菌株SF （pTR-Plac-lba）、SF （pTR-Plac-lbc1）、SF （pTR-Plac-lbc2）、SF （pTR-Plac-lbc3）、SF （pTR-Plac-lbX）的大豆植株在植株的高度、鲜重、干重、结瘤数、根瘤固氮酶活性以及大豆产量等方面均有不同程度的显著提高；与作为另一个对照的接种土著大豆根瘤菌的大豆植株相比,接种转基因工程菌株SFH （pTR-Plac-lba）、SFH （pTR-Plac-lbc1）、SFH （pTR-Plac-lbc2）、SFH （pTR-Plac-lbc3）、SFH （pTR-Plac-lbX）的大豆植株在植株的高度、鲜重、干重、结瘤数、根瘤固氮酶活性以及大豆产量等方面均有不同程度的显著提高。通过对接种不同转基因根瘤菌工程菌株的大豆植株各种生理指标的比较发现,5种重组载体的增效作用依次为pTR-Plac-lba>pTR-Plac-lbc3>pTR-Plac-lbX>pTR-Plac-lbc2> pTR-Plac-lbc1。盆栽实验结果同时表明,对分别接种快生型大豆根瘤菌15067和土著大豆根瘤菌的大豆植株各生理指标比较发现,土著大豆根瘤菌的增效作用好于快生型大豆根瘤菌15067,并且,对同一重组载体分别转入两出发菌株后获得的工程菌株比较,转土著大豆根瘤菌获得的工程菌株的增效作用好于转快生型大豆根瘤菌15067获得的工程菌株。本研究获得“哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目”和“黑龙江省科技攻关项目”的资助。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 前言
• 1.1 生物固氮
• 1.1.1 生物固氮的分类
• 1.1.2 生物固氮的意义
• 1.2 大豆血红蛋白
• 1.2.1 大豆血红蛋白的结构与性质
• 1.2.2 大豆血红蛋白的功能
• 1.2.3 大豆血红蛋白基因的结构、组成及其时空特异性表达
• 1.3 快生型大豆根瘤菌
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.5 本研究的技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒载体
• 2.1.3 供试菌株
• 2.1.4 实验试剂
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大豆根瘤cDNA的获得
• 2.2.2 大豆血红蛋白基因全长的获得
• 2.2.3 原核表达载体的构建
• 2.2.4 转基因大豆根瘤菌工程菌株的构建
• 2.2.5 转基因工程菌株的检测
• 2.2.6 质粒的遗传稳定性测定
• 2.2.7 盆栽实验
• 2.2.8 固氮酶活性的测定
• 2.2.9 统计分析方法
• 第3章 结果与分析
• 3.1 大豆根瘤总RNA的提取
• 3.2 大豆血红蛋白基因的扩增及生物信息学分析
• 3.2.1 大豆血红蛋白基因的PCR扩增
• 3.2.2 目的基因的生物信息学分析
• 3.3 表达载体的构建
• 3.3.1 重组载体的构建
• 3.3.2 原核表达载体的构建
• 3.4 大豆根瘤菌工程菌株的构建及检测
• 3.4.1 大豆根瘤菌工程菌株的筛选
• 3.4.2 转基因大豆根瘤菌工程菌株的检测
• 3.5 质粒的遗传稳定性测定
• 3.5.1 自生传代培养条件下质粒的稳定性检测
• 3.5.2 共生条件下质粒的稳定性检测
• 3.6 盆栽实验结果
• 3.6.1 转化快生型大豆根瘤菌15067的工程菌株的盆栽实验结果
• 3.6.2 转化土著大豆根瘤菌的工程菌株的盆栽实验结果
• 第4章 讨论
• 4.1 原核表达载体的选择
• 4.2 串联成簇基因表达载体的构建
• 4.3 表达载体的转化
• 4.4 不同表达载体的增效差异
• 4.5 下一步实验设想
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文