促红细胞生成素对心肌细胞肥大影响的实验研究

论文摘要

促红细胞生成素（Erythropoietin,Epo）是一种低氧诱导的谱系特异性的内分泌激素,可调节红细胞的形成,临床上广泛应用于各种原因引起的贫血,如终末期肾病、获得性免疫缺陷综合征以及需要化疗的非造血系统恶性肿瘤。后来研究发现Epo受体在心血管系统有着广泛的分布,基础研究揭示Epo可保护缺血再灌注心肌和限制心肌梗死的范围。有关Epo对心肌细胞肥大影响的报导在国内外非常有限。本研究以Epo作为干预因素,离体培养新生大鼠心肌细胞作为研究对象,以明确Epo对心肌肥大的影响并初步探讨其肥厚相关的信号通路。第一部分新生大鼠心肌离体培养和Epo刺激后形态学观察目的:1)取得稳定的新生大鼠心肌细胞离体培养模型,cTnI免疫组化染色观察Epo刺激不同时间对于心肌细胞大小的影响;2)观察Epo刺激引起的细胞超微结构改变。方法:取新生大鼠原代心肌细胞经10%FBS的DMEM培养液培养24h,更换为2%FBS低血清培液同步化24h。实验分为:空白对照组、AngⅡ组和Epo组。AngⅡ终浓度为1×10-6M;Epo终浓度为10U/ml。于24h、48h和72h固定各组细胞,cTnI免疫组化染色,光镜下测量心肌细胞面积。电镜观察心肌细胞超微结构所用的低血清培养液含0.1%FBS,实验分组同前。于24h、48h和72h固定各组细胞,电镜下观察各组心肌细胞超微结构。结果:1)干预24h,对照组心肌细胞面积2135.6±524.8μm2,AngⅡ干预组3202.3±661.2μm2,Epo组2586.2±165.3μm2,AngⅡ组相比对照组和Epo组,心肌细胞明显增大,P＜0.05。干预48h,对照组心肌细胞面积1844.5±323.3μm2,AngⅡ干预组3321.0±428.8μm2,Epo组3318.9±321.3μm2,AngⅡ组和Epo组相比对照组,心肌细胞明显增大,P＜0.05;AngⅡ组与Epo组相比,差别无统计学意义。干预72h,对照组心肌细胞面积2213.90±149.5μm2,AngⅡ干预组3222.20±225.3μm2,Epo组3317.20±196.1μm2,AngⅡ组和Epo组相比对照组,心肌细胞明显增大,P＜0.05;AngⅡ组与Epo组相比,差别无统计学意义。Epo干预48h和干预72h相比24h组,细胞面积明显增大,P＜0.05。2)电镜观察,培养72h,对照组心肌细胞肌丝溶解,细胞器大多破坏;AngⅡ组和Epo组细胞核不规则,核膜凹陷,核仁较清晰,染色质浅;线粒体数量增多,肿胀;内质网以及高尔基器等与合成分泌有关的细胞器发达,72小时观察到细胞内出现亚细胞结构的空泡化改变。结论:Epo刺激可使心肌细胞增大,使心肌细胞出现肥厚的亚细胞结构改变。第二部分Epo对心肌细胞蛋白激酶活性及肥大相关基因的影响目的:考察Epo刺激后细胞外信号调节激酶ERK的激活和心肌细胞肥大相关基因ANP、BNP、c-fos mRNA的表达量的变化。方法:取新生大鼠原代心肌细胞经10%FBS的DMEM培养液培养24h,更换为0.1%FBS低血清培液同步化24h,加入Epo干预。1)Epo终浓度为10U/ml,分别在0 min（对照组）、10min、15min、30min、60min和120min终止干预,提取心肌细胞总蛋白,Western blot检测心肌细胞磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）含量;2)Epo终浓度为0 U/ml（对照组）、5 U/ml、10 U/ml、100 U/ml,干预30min,提取心肌细胞总蛋白,Western blot检测心肌细胞p-ERK1/2含量;3)实验分两组,对照组和Epo组,Epo10U/ml干预30min,提取心肌细胞总RNA,RT—PCR法测定两组c-fos mRNA表达量;同样Epo和对照组分组干预2h,RT—PCR法测定ANP mRNA和BNP mRNA表达量。结果:1)Epo10U/ml干预心肌细胞后p-ERK2表达随时间出现先升高后下降的变化,30min时达到高峰,与干预前和干预后120min相比,P＜0.05;p-ERK1在Epo干预后也观察到先升高后降低的趋势。2)Epo不同浓度干预心肌细胞,随Epo干预浓度增大,p-ERK2水平升高,10 U/ml及100 U/ml浓度干预组与对照组相比,差别有统计学意义（P＜0.05）。p-ERK1在Epo处理后也观察到随浓度升高而升高的趋势。3)Epo10U/ml干预心肌细胞,RT-PCR结果显示,30min c-fosmRNA表达量与对照组相比差异不明显,2h ANP mRNA和BNP mRNA表达量和对照组相比,明显升高,P＜0.05。结论:1)Epo刺激使心肌细胞p-ERK1/2呈时间相关性和浓度依赖性升高;2)要观察p-ERK1/2变化,可取Epo10U/ml刺激30min做为最佳观察条件;2)Epo刺激促进了心肌肥大相关基因表达。第三部分Epo引起心肌细胞肥大反应信号通路初探目的:1)观察Epo刺激对心肌AGT mRNA表达量的影响;2)初步探讨心肌中Epo-ERK信号通路和RAS系统之间是否存在相互关系。方法:取新生大鼠原代心肌细胞经10%FBS的DMEM培养液培养24h,更换为0.1%FBS低血清培养液同步化24h,开始分组干预。1)Epo10U/ml干预细胞,分别在0h（对照组）、1h、2h、6h、12h、24h提取心肌细胞总RNA,RT-PCR法测定并比较干预不同时间后AGT mRNA表达量。2)实验分为6组:a)空白对照组;b)AngⅡ组:AngⅡ1×10-6M 8min;c)ARB+AngⅡ组:替米沙坦1×10-6M阻断30min后加入AngⅡ1×10-6M 8min;d)Epo组:Epo 10U/ml 30min;e)ACEI+Epo组:依那普利1×10-6M阻断2h后加入Epo 10U/ml 30min;f)ARB+Epo组:替米沙坦1×10-6M阻断30min后加入Epo 10U/ml 30min。干预结束提取心肌细胞总蛋白,Western blot测定各组心肌细胞p-ERK1/2含量。3)实验分3组:a)空白对照组;b)Epo组:Epo 10U/ml 6h;c)PD98059+Epo组:PD98059浓度50×10-6M阻断30min后加入Epo 10U/ml 6h。终止干预,提取心肌细胞总RNA,比较三组的AGT mRNA表达量。结果:1)Epo10U/ml干预心肌细胞24h,使AGT mRNA表达量自2h起升高（P＜0.05）,随干预时间延长表现为先上升后下降趋势,6h时AGT mRNA表达量水平最高。2)Epo干预心肌p-ERK1/2的升高可被依那普利和替米沙坦所逆转。3)p-ERK1/2的阻断,并不能逆转Epo对于AGT mRNA表达的促进作用。结论:Epo可上调心肌细胞中AGT基因的转录,Epo激活ERK信号通路与RAS系统存在相互关系。

论文目录

• 英文缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 新生大鼠心肌离体培养和Epo刺激后形态学观察
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Epo对心肌细胞蛋白激酶活性及肥大相关基因的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Epo引起心肌细胞肥大反应信号通路初探
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 在读期间发表文章
• 致谢