首页> 正文

甘油去阻遏表型巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）的构建及其初步研究

2020-12-07阅读(889)

甘油去阻遏表型巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）的构建及其初步研究

论文摘要

1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。其中以Pichia pastoris（巴斯德毕赤酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速,应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用,原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外,还有以下几个优点:1)具有醇氧化酶1（AOX1）基因启动子,这是目前最强,调控机理最严格的启动子之一;2)表达质粒是整合型载体,能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合,克服了酿酒酵母中附加体形式质粒的遗传不稳定性缺陷;3)生产繁殖速度快,营养要求低,培养基经济廉价,具强烈的好氧生长偏爱性,能够耐受较高的流体净压,故可高密度发酵培养,在发酵罐中细胞干重可达120g/L以上,便于大规模工业化生产;4)毕赤酵母中存在过氧化物酶体,表达的蛋白贮存其中,可免受蛋白酶的降解,而且减少对细胞的毒害作用;5)超糖基化发生的概率较小,分泌蛋白的核心糖链结构是Man8GlcNAc2或Man9GlcNAc2,糖链平均为8-14个甘露糖基,可避免酿酒酵母菌中高甘露糖型寡糖链的超糖基化,而且Pichia pastoris可形成分支糖链,但糖链末端不存在α-1,3甘露聚糖（α-1,3甘露聚糖是人体内不存在的一种糖链结构,所以这种结构能引起人体不良有害的免疫反应）,故N-乙酰糖基化修饰较酿酒酵酵母更接近于高等真核生物;6)毕赤酵母分泌到胞外的内源性蛋白的量很少,分泌到胞外的重组蛋白的纯度相对较高,易于纯化,非常适用于基础研究领域;7)另外,表达的外源蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞外。到目前为止,巴斯德毕赤酵母基因表达系统已高效表达了HBsAg、HSA、TNF、EGF、破伤风毒素C片段和基因工程抗体等700多种外源基因,表达量最高可达到每升克级水平,证实该系统为高效、实用、简便,以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统,而且非常适宜扩大为工业规模。虽然毕赤酵母表达系统由于其一些显著的优点,不仅应用于工业生产而且被应用到了基础研究领域,但是它还不是一个非常完善的表达系统,目前还不可能完全替代其他的表达系统,具有一定的相对局限性:1)发酵周期较长,易污染,且长时间发酵不利于外源蛋白的表达;2)一些外源蛋白在毕赤酵母分泌过程中,会受到某些蛋白酶的作用而发生降解,而且降解的蛋白随成熟的蛋白一起分泌至胞外,不仅降低了目的蛋白的的产量,而且由于在表达上清中降解蛋白的存在,给后续分离纯化带来了不利的影响;3)虽然毕赤酵母表达系统具有一个较完善的蛋白质翻译后修饰加工和正确折叠的机制,但是与高等真核生物的对应机制还是有所差别,尤其是在糖基化修饰方面:毕赤酵母中N-连接糖链的结构可表示为MannGlcNAc2,但高等真核生物表达的糖蛋白（尤其是复杂型寡糖链结构）还包括唾液酸、半乳糖和果糖等糖基,由于寡糖连的结构常常涉及蛋白的免疫原性,所以在表达高等真核来源的糖蛋白时,毕赤酵母表达系统所得的产物很可能就不是其天然结构,故而影响蛋白的一些生物学性质;4)到目前为止,毕赤酵母表达的重组蛋白的表达水平不均一,有的已达到每升克级的水平,但有些蛋白有可能只有每升毫克级甚至是微克级水平,尤其是在表达一些低分子量的蛋白时,表达水平往往比较低,因此,毕赤酵母表达系统还不是个很广谱的表达宿主;5)由于AOX1启动子受分解代谢物阻遏作用的调控,Mut+表型的毕赤酵母菌如果进行大规模发酵罐培养,一般分成三相发酵,即甘油批次相、甘油补料相和甲醇诱导相。然而,由于甘油批次相和甘油补料相积累了大量的菌体,在诱导相需提供大量的甲醇才能维持所有菌体正常的碳源需要以及满足AOX1启动子的高效诱导,但是高浓度甲醇易挥发具易燃性,以甲醇为原料培养具一定的安全隐患,对发酵罐安全系数要求高,增加发酵罐设计成本,从而增加了生产成本;同时,由于采用三相发酵法,人为延长了发酵周期,导致过程消耗增加,从而也增加了生产成本。毕赤酵母的这些局限,尤其是三相发酵法引起的毕赤酵母一些工业发酵急需解决的问题,是本课题关注的核心。导致这些问题的根本原因,还是由于AOX1启动子受分解代谢物阻遏作用的调控,这里主要表现为甲醇对AOX1启动子的诱导活化作用受到甘油等抑制性碳源的抑制。因此,要解决三相发酵法带来的这些问题,首先需要对AOX1启动子顺式作用元件及其反式作用因子进行探索,弄清楚AOX1启动子分解代谢物阻遏机制。在酿酒酵母、假丝酵母和汉逊多形酵母中,通过各种突变技术,分离得到与分解代谢物阻遏相关的基因,如GCR1、MIG1等。在巴斯德毕赤酵母分解代谢物阻遏方面,日本已有研究者通过化学诱变技术筛选得到一株葡萄糖去阻遏的酵母菌株,并申请了专利。因此,本研究拟使用LacZ蛋白作为报告蛋白,在GS115 yps1?菌株中通过两个突变方案构建甘油去阻遏的巴斯德毕赤酵母菌株:第一,通过REMI技术在GS115 yps1?菌株基因组引入随机突变,致使与甘油阻遏相关基因失活,然后筛选去阻遏菌株;第二,通过Error-prone PCR技术,扩增AOX1启动子,得到含有多个突变的启动子,再将此突变启动子克隆至表达载体LacZ基因上游,以控制LacZ基因表达,然后,将此载体转化GS115 yps1?酵母细胞并筛选甘油去阻遏的菌株。通过REMI技术,本研究获得在BMGMY培养基中表达LacZ的GS115-pPIC9-LacZ yps1? GR?突变株,并通过质粒拯救和TAIL-PCR技术从该菌株中分离得到一个与甘油阻遏相关的基因GR1,结合Cre-loxP重组敲除技术将其敲除失活,得到GS115 yps1? gr1?菌株,该菌株表现为甘油去阻遏,即能够在甘油存在下由甲醇诱导表达外源蛋白,如LacZ和HSA-AX15（R13K）蛋白。通过Error-prone PCR技术,本研究构建了AOX1启动子随机突变库,并将其转化GS115 yps1?酵母细胞,筛选得到三株在BMGMY培养基中表达LacZ的GS115-pPIC9ZαA-LacZ yps1? ep1,2,3菌株,在此基础上初步确定了AOX1启动子上与甘油阻遏相关的区域,而且将该相关区域突变的启动子克隆至pPIC9b载体,构建得到pPIC9AM载体,然后,将该质粒转化GS115 yps1?酵母细胞酵母细胞,所得菌株能够在甘油存在下由甲醇诱导表达外源蛋白,如LacZ和HSA-AX15（R13K）蛋白。

论文目录

  • 缩略词表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 1. 酵母表达系统概况
  • 1.1 毕赤酵母表达系统优点及其应用
  • 1.2 毕赤酵母表达系统存在的问题
  • 2. 限制酶介导整合技术
  • 2.1 REMI 技术的基本原理
  • 2.2 REMI 技术的应用现状
  • 3. Cre-loxP 同源重组系统
  • 4. TAIL-PCR 技术
  • 5. Error-prone PCR
  • 6. 本课题目的及意义
  • 第一章：Pichia pastoris 适用的Cre-loxP 重组系统构建与初步评价
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 菌株、质粒和细胞
  • 1.1.2 工具酶和分子量标准
  • 1.1.3 主要试剂、耗材及试剂盒
  • 1.1.4 主要仪器及配件
  • 1.1.5 主要溶液
  • 1.1.6 主要培养基
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 pLOXP-Z 载体的构建
  • 1.2.1.1 LML 片段体外构建
  • 1.2.1.2 pUC+Zeo 片段的PCR 扩增
  • 1.2.1.3 LML 片段和pUC+Zeo 片段PstI/XhoI 双酶切
  • 1.2.1.4 LML 片段和pUC+Zeo 片段PstI/XhoI 酶切产物连接
  • 1.2.1.5 LML 片段和pUC+Zeo 片段的酶切产物转化大肠杆菌DH5α
  • 1.2.1.6 pLOXP-Z 质粒菌落PCR 筛选
  • 1.2.1.7 pLOXP-Z 质粒PstI/XhoI 酶切鉴定
  • 1.2.2 pGAP-Z 质粒的构建
  • 1.2.2.1 GS115 基因组DNA 提取
  • 1.2.2.2 GAP 启动子扩增
  • 1.2.2.3 GAP 启动子与pPICZαA 质粒BglII/EcoRI 酶切
  • 1.2.2.4 GAP 启动子与pPICZαA 质粒BglII/EcoRI 酶切产物连接
  • 1.2.2.5 GAP 启动子与pPICZαA 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 1.2.2.6 pGAP-Z 质粒菌落PCR 筛选
  • 1.2.2.7 pGAP-Z 质粒BglII/EcoRI 酶切鉴定
  • 1.2.3 pGAPA 质粒的构建
  • 1.2.3.1 GAP+AOX1TT 片段的克隆
  • 1.2.3.2 Amp+ColE1 片段的克隆
  • 1.2.3.3 GAP+AOX1TT 片段与Amp+ColE1 片段BglII/SpeI 酶切
  • 1.2.3.4 GAP+AOX1TT 片段与Amp+ColE1 片段BglII
  • 1.2.3.5 GAP+AOX1TT 与Amp+ColE1 的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 1.2.3.6 pGAPA 质粒菌落PCR 筛选
  • 1.2.3.7 pGAPA 质粒BglII/SpeI 酶切鉴定
  • 1.2.4 pGAPK 质粒的构建
  • 1.2.4.1 Kanamycin 抗性基因片段的克隆
  • 1.2.4.2 Kanamycin 抗性基因片段与pGAPA 质粒BglII 酶切
  • 1.2.4.3 Kanamycin 抗性基因片段与pGAPA 质粒BglII 酶切产物连接
  • 1.2.4.4 Kanamycin 片段与pGAPA 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 1.2.4.5 pGAPK 质粒菌落PCR 筛选
  • 1.2.4.6 pGAPK 质粒BglII 酶切鉴定
  • 1.2.5 pARSK 质粒的构建
  • 1.2.5.1 Pichia pastoris 自主复制序列ARS 片段的克隆
  • 1.2.5.2 Pp-ARS 片段与pGAPK 质粒BamHI/SpeI 酶切
  • 1.2.5.3 Pp-ARS 片段与pGAPK 质粒BamHI/SpeI 酶切产物连接
  • 1.2.5.4 Pp-ARS 片段与pGAPK 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 1.2.5.5 pARSK 质粒菌落PCR 筛选
  • 1.2.5.6 pARSK 质粒BamHI/SpeI 酶切鉴定
  • 1.2.6 pCREK 质粒的构建
  • 1.2.6.1 Cre 重组酶基因的克隆
  • 1.2.6.2 Cre 重组酶基因片段与pARSK 质粒EcoRI/NotI 酶切
  • 1.2.6.3 Cre 重组酶基因片段与pARSK 质粒EcoRI/NotI 酶切产物连接
  • 1.2.6.4 Cre 基因片段与pARSK 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 1.2.6.5 pCREK 质粒菌落PCR 筛选
  • 1.2.6.6 pCREK 质粒EcoRI/NotI 酶切鉴定
  • 1.2.7 pYPS1-delta 质粒的构建
  • N和YPS1C 片段扩增'>1.2.7.1 同源臂YPS1N和YPS1C片段扩增
  • 1.2.7.2 融合PCR 构建YPS1（C+N）片段
  • 1.2.7.3 YPS1（C+N）片段和pLOXP-Z 质粒BglII/SalI 酶切
  • 1.2.7.4 YPS1（C+N）片段和pLOXP-Z 质粒BglII/SalI 酶切产物连接
  • 1.2.7.5 YPS1（C+N）和pLOXP-Z 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 1.2.7.6 pYPS1-delta 质粒菌落PCR 筛选
  • 1.2.7.7 pYPS1-delta 质粒BglII/SalI 酶切鉴定
  • 1.2.8 GS115 菌株YPS1 基因敲除与PCR 筛选鉴定
  • 1.2.8.1 pYPS1-delta 质粒ScaI 酶切与回收
  • 1.2.8.2 GS115 感受态细胞制备与转化
  • 1.2.8.3 Zeocin 抗性重组子基因组DNA 提取
  • 1.2.8.4 PCR 鉴定Zeocin 抗性重组子
  • 1.2.9 GS115 YPS1△::Shble 菌株中Zeocin 抗性基因（Sh ble）剔除
  • 1.2.9.1 GS115 YPS1△::Shble 菌株感受态细胞制备与转化
  • 1.2.9.2 含有pCREK 质粒的GS115 YPS1△::Shble 菌株传代培养
  • 1.2.9.3 传代培养去除pCREK 质粒
  • 1.2.10 GS115 YPS1△菌株Southern Blot 分析鉴定
  • 1.2.11 GS115-pPIC9-HSA-AX15（R13K） YPS1△和GS115-pPIC9 YPS1△菌株构建
  • 1.2.11.1 GS115 YPS1△菌株感受态细胞制备与转化
  • 1.2.11.2 GS115-pPIC9-HSA-AX15（R13K） YPS1△和GS115-pPIC9 YPS1△菌株甲醇利用表型确定
  • 1.2.11.3 GS115-pPIC9-HSA-AX15（R13K）工程菌摇瓶诱导表达
  • 1.3 实验结果
  • 1.3.1 pLOXP-Z 载体的构建
  • 1.3.2 pCREK 质粒的构建
  • 1.3.2.1 pGAP-Z 质粒的构建
  • 1.3.2.2 pGAPA 质粒的构建
  • 1.3.2.3 pGAPK 质粒的构建
  • 1.3.2.4 pARSK 质粒的构建
  • 1.3.2.5 pCREK 质粒的构建
  • 1.3.3 Cre-loxP 重组系统的初步评价
  • 1.3.3.1 pYPS1-delta 打靶质粒的构建
  • 1.3.3.2 GS115 YPS1△菌株的构建
  • 第二章：Pichia pastoris LacZ 模式菌株构建
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 菌株、质粒和细胞
  • 2.1.2 工具酶和分子量标准
  • 2.1.3 主要试剂及试剂盒
  • 2.1.4 主要仪器及配件
  • 2.1.5 主要溶液
  • 2.1.6 主要培养基
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 pEM22b 载体的构建
  • 2.2.1.1 EM7 启动子PCR 扩增
  • 2.2.1.2 EM7 启动子PCR 片段和pET226（+）载体BglII/NdeI 酶切
  • 2.2.1.3 EM7 启动子片段和pET226（+）载体BglII/NdeI 酶切产物连接
  • 2.2.1.4 EM7 片段和pET226（+）载体的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 2.2.1.5 pEM22b 质粒菌落PCR 筛选
  • 2.2.1.6 pEM22b 质粒BglII/NdeI 酶切鉴定
  • 2.2.2 pEM22b-LacZ 质粒的构建
  • 2.2.2.1 lacZ 基因PCR 扩增
  • 2.2.2.2 lacZ 基因PCR 扩增产物和pEM22b 载体BamHI/NcoI 酶切
  • 2.2.2.3 lacZ 基因和pEM22b 载体BamHI/NcoI 酶切产物连接
  • 2.2.2.4 lacZ 基因和pEM22b 载体的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 2.2.2.5 pEM22b-LacZ 质粒AvrII/XhoI 酶切鉴定
  • 2.2.3 pPIC9-LacZ 质粒的构建
  • 2.2.3.1 pPIC9 载体AvrII/XhoI 酶切
  • 2.2.3.2 lacZ 基因pPIC9 载体的AvrII/XhoI 酶切产物连接
  • 2.2.3.3 lacZ 基因pPIC9 载体的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 2.2.3.4 pPIC9-LacZ 质粒菌落PCR 筛选
  • 2.2.3.5 pPIC9-LacZ 质粒菌落AvrII/XhoI 酶切鉴定
  • 2.2.4 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△工程菌构建
  • 2.2.4.1 pPIC9-LacZ 质粒BglII 酶切与回收
  • 2.2.4.2 GS115 YPS1△感受态细胞制备与转化
  • 2.2.4.3 筛选GS115-pPIC9-LacZ YPS1△工程菌阳性克隆
  • 2.2.4.4 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△工程菌甲醇利用表型确定
  • 2.3 实验结果
  • 2.3.1 pEM22b 载体构建
  • 2.3.2 pEM22b-LacZ 质粒构建
  • 2.3.3 pPIC9-LacZ 质粒构建
  • 2.3.4 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△模式菌株构建
  • 第三章：REMI 突变库技术构建甘油去阻遏Pichia pastoris 菌株及其评价
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 菌株、质粒和细胞
  • 3.1.2 工具酶和分子量标准
  • 3.1.3 主要试剂、耗材及试剂盒
  • 3.1.4 主要仪器及配件
  • 3.1.5 主要溶液
  • 3.1.6 主要培养基
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 pREMI-Z 质粒的构建
  • 3.2.1.1 TBS 片段体外构建
  • 3.2.1.2 TBS 片段PstI/XhoI 双酶切
  • 3.2.1.3 TBS 片段和pUC+Zeo 片段PstI/XhoI 酶切产物连接
  • 3.2.1.4 TBS 片段和pUC+Zeo 片段的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 3.2.1.5 pREMI-Z 质粒菌落PCR 筛选
  • 3.2.1.6 pREMI-Z 质粒PstI/XhoI 酶切鉴定
  • 3.2.2 毕赤酵母GS115-pPIC9-LacZ YPS1△菌株REMI 随机突变库构建与筛选
  • 3.2.2.1 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△感受态细胞制备与转化
  • 3.2.2.2 Zeocin 抗性重组子菌落影印接种及阳性重组子验证
  • 3.2.3 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ GR?菌株Southern Blot 分析
  • 3.2.4 GR1 基因分离与克隆
  • 3.2.4.1 pREMI-Z 质粒拯救
  • 3.2.4.2 5’TAIL-PCR 和3’TAIL-PCR
  • 3.2.4.3 GR1 基因全序列克隆
  • 3.2.5 pGR1-delta 质粒的构建
  • N和GR1C 片段扩增'>3.2.5.1 同源臂GR1N和GR1C片段扩增
  • 3.2.5.2 融合PCR 构建GR1（C+N）片段
  • 3.2.5.3 GR1（C+N）片段和pLOXP-Z 质粒NdeI 酶切
  • 3.2.5.4 GR1（C+N）片段和pLOXP-Z 质粒NdeI 酶切产物连接
  • 3.2.5.5 GR1（C+N）和pLOXP-Z 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 3.2.5.6 pGR1-delta 质粒菌落PCR 筛选
  • 3.2.5.7 pGR1-delta 质粒NdeI 酶切鉴定
  • 3.2.6 GS115 菌株GR1 基因敲除及其PCR 筛选鉴定
  • 3.2.6.1 pGR1-delta 质粒DraI 酶切与回收
  • 3.2.6.2 GS115 YPS1△感受态细胞制备与转化
  • 3.2.6.3 Zeocin 抗性重组子基因组DNA 提取
  • 3.2.6.4 PCR 鉴定Zeocin 抗性重组子
  • 3.2.7 GS115 YPS1△ gr1△::Shble 菌株中Zeocin 抗性基因（Sh ble）剔除
  • 3.2.7.1 GS115 YPS1△ gr1△::Shble 菌株感受态细胞制备与转化
  • 3.2.7.2 含有pCREK 质粒的GS115 YPS1△ gr1△::Shble 菌株传代培养
  • 3.2.7.3 传代培养去除pCREK 质粒
  • 3.2.8 GS115 YPS1△ gr1△菌株Southern Blot 分析鉴定
  • 3.2.9 GS115 YPS1△ gr1△菌株生长与形态测定
  • 3.2.9.1 GS115 YPS1△ gr1△菌株生长曲线
  • 3.2.9.2 GS115 YPS1△ gr1△菌株革兰氏染色
  • 3.2.10 GS115-pPIC9-HSA-AX15（R13K） YPS1△ gr1△和GS115-pPIC9-LacZ YPS1△gr1△菌株构建
  • 3.2.10.1 GS115 YPS1△ gr1△菌株感受态细胞的制备与转化
  • 3.2.10.2 GS115-pPIC9-HSA-AX15（R13K） YPS1△ gr1△和 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ gr1△菌株甲醇利用表型确定
  • 3.2.11 GS115-pPIC9-HSA-AX15（R13K）工程菌摇瓶诱导表达
  • 3.2.12 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△与GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ gr1△菌株LacZ 表达水平检测
  • 3.2.13 GS115 YPS1△ gr1△菌株中AOX1 活性检测
  • 3.3 实验结果
  • 3.3.1 pREMI-Z 质粒的构建
  • 3.3.2 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△菌株REMI 随机突变库构建与筛选鉴定
  • 3.3.3 GR1 基因分离与克隆
  • 3.3.4 pGR1-delta 打靶质粒的构建
  • 3.3.5 GS115 YPS1△ gr1△菌株的构建
  • 3.3.6 GS115-pPIC9-HSA-AX15（R13K） YPS1△ gr1△菌株诱导表达
  • 3.3.7 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ gr1△菌株LacZ 表达水平测定
  • 3.3.8 GS115 YPS1△ gr1△菌株中AOX1 活性检测
  • 第四章：Error-prone PCR 突变库技术构建甘油去阻遏Pichia pastoris 菌株
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 菌株、质粒和细胞
  • 4.1.2 工具酶和分子量标准
  • 4.1.3 主要试剂及试剂盒
  • 4.1.4 主要仪器及配件
  • 4.1.5 主要溶液
  • 4.1.6 主要培养基
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 pPIC9ZαA-LacZ 质粒的构建
  • 4.2.1.1 Zeo+pUC（SpeI）片段克隆
  • 4.2.1.2 Zeo+pUC（SpeI）片段BamHI/BglII 酶切
  • 4.2.1.3 Zeo+pUC（SpeI）片段BamHI/BglII 酶切产物连接
  • 4.2.1.4 Zeo+pUC（SpeI）片段和pPIC9-LacZ BglII 大片段的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 4.2.1.5 pPIC9ZαA-LacZ 质粒菌落PCR 筛选
  • 4.2.1.6 pPIC9ZαA-LacZ 质粒BamHI/SpeI 酶切鉴定
  • 4.2.2 AOX1 启动子随机突变库构建
  • 4.2.2.1 Error-prone PCR 扩增AOX1 启动子
  • 4.2.2.2 AOX1 启动子Error-prone PCR 产物Bam HI/SpeI 酶切
  • 4.2.2.3 AOX1 启动子BamHI/SpeI 酶切连接
  • 4.2.2.4 AOX1 启动子和pPIC9ZαA-LacZ 的连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 4.2.2.5 AOX1 启动子随机突变库收集
  • 4.2.3 GS115-pPIC9ZαA-LacZ-ep YPS1△菌株构建及筛选鉴定
  • 4.2.3.1 GS115 YPS1△菌株感受态细胞制备与转化
  • 4.2.3.2 影印接种
  • 4.2.4 AOX1 启动子突变序列分析
  • 4.2.5 GS115-pPIC9ZαA-LacZ-epN 菌株LacZ 表达水平测定
  • 4.2.6 pPIC9AM 载体的构建
  • 4.2.6.1 AOX1 突变启动子AOX1-Mu 片段扩增
  • 4.2.6.2 AOX1-Mu 片段BamHI/BglII 酶切
  • 4.2.6.3 AOX1-Mu 片段BamHI/BglII 酶切产物连接
  • 4.2.6.4 AOX1-Mu 片段和pPIC9 大片段连接产物转化大肠杆菌DH5α
  • 4.2.6.5 pPIC9AM 载体菌落PCR 筛选
  • 4.2.6.6 pPIC9AM 质粒BamHI/BglII 酶切鉴定
  • 4.2.7 GS115-pPIC9AM-HSA-AX15（R13K） yps1? 和 GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株构建
  • 4.2.7.1 pPIC9AM-HSA-AX15（R13K）与pPIC9AM-LacZ 质粒构建
  • 4.2.7.2 GS115 YPS1△菌株感受态细胞的制备与转化
  • 4.2.7.3 GS115-pPIC9AM-HSA-AX15（R13K） yps1?和 GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株甲醇利用表型确定
  • 4.2.8 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△与GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株LacZ 表达水平检测
  • 4.2.9 GS115-pPIC9AM-HSA-AX15（R13K）工程菌摇瓶诱导表达
  • 4.3 实验结果
  • 4.3.1 pPIC9ZαA-LacZ 质粒的构建
  • 4.3.2 AOX1 启动子随机突变库构建
  • 4.3.3 甘油去阻遏的GS115-pPIC9ZαA-LacZ-ep YPS1△菌株构建与筛选鉴定
  • 4.3.4 AOX1 启动子突变序列分析
  • 4.3.5 GS115-pPIC9ZαA-LacZ-epN YPS1△菌株LacZ 表达水平测定
  • 4.3.6 pPIC9AM 载体的构建
  • 4.3.7 GS115-pPIC9AM-HSA-AX15（R13K） YPS1△菌株诱导表达
  • 4.3.8 GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株LacZ 表达水平测定
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 个人简历
  • 攻读期间发表的研究论文

    • 相关论文文献

    • [1].Improved extracellular endo-1,4-β-mannosidase activity of recombinant Pichia pastoris by optimizing signal peptide[J]. Journal of Central South University 2015(06)
    • [2].Occurrence and Diversity of Pichia spp. in Marine Environments[J]. Journal of Ocean University of China 2008(03)
    • [3].Pichia pastoris表达系统的启动子研究进展[J]. 工业微生物 2008(06)
    • [4].高效液相色谱法同时测定Pichia pastoris发酵过程中腺苷甲硫氨酸相关的六种物质[J]. 工业微生物 2008(01)
    • [5].Pichia pastoris表达系统提高表达量的几个关键点[J]. 海南大学学报(自然科学版) 2008(01)
    • [6].High-level expression and purification of Plutella xylostella acetylcholinesterase in Pichia pastoris and its potential application[J]. Journal of Integrative Agriculture 2017(06)
    • [7].Codon Optimization of SMAP-29 Gene and Its Expression in Pichia pastoris[J]. Agricultural Biotechnology 2012(04)
    • [8].Fusion Expression of Glucoamylase and Xylanase in Pichia pastoris[J]. Agricultural Biotechnology 2012(05)
    • [9].Expression and Characterization of HIV-1 Envelope Glycoprotein in Pichia Pastoris[J]. Chemical Research in Chinese Universities 2008(03)
    • [10].利用Pichia pastoris生产S-腺苷甲硫氨酸的发酵工艺[J]. 工业微生物 2008(03)
    • [11].Expression and Characterization of an Active Chimeric Protein of Human Extracellular Superoxide Dismutase and hCuZnSOD in Pichia pastoris[J]. Chemical Research in Chinese Universities 2010(02)
    • [12].Expression and Characterization of a Thermostable Xylanase Gene xynA from a Themophilic Fungus in Pichia pastoris[J]. Agricultural Sciences in China 2011(03)
    • [13].Cloning and Characterization of a Galactomannan-degrading Enzyme Gene in Pichia pastoris[J]. Agricultural Biotechnology 2015(05)
    • [14].Expression and Characterization of a Recombinant Truncated Capsid Protein of Hepatitis E Virus in Pichia pastoris[J]. Chemical Research in Chinese Universities 2010(02)
    • [15].Expression of ChIFN-α in Pichia pastoris and Optimization of Its Expression Condition[J]. Animal Husbandry and Feed Science 2016(05)
    • [16].Enhancing ergosterol production in Pichia pastoris GS115 by overexpressing squalene synthase gene from Glycyrrhiza uralensis[J]. Chinese Journal of Natural Medicines 2015(05)
    • [17].Expression and self-assembly of Heterocapsa circularisquama RNA virus-like particles synthesized in Pichia pastoris[J]. Chinese Science Bulletin 2012(25)
    • [18].A novel treatment for weight reduction by the recombinant "Pichia pastoris" yeast expressing the hybrid protein of "irisin-furin-transferrin"[J]. Journal of Integrative Medicine 2016(01)
    • [19].Expression, Characterization and Antimicrobial Ability of a Variant T4 Lysozyme in Pichia pastoris[J]. Agricultural Science & Technology 2014(03)
    • [20].Expression and Purification of Enterovirus Type 71 Polyprotein P1 using Pichia pastoris system[J]. Virologica Sinica 2012(04)
    • [21].人组织激肽释放酶在Pichia pastoris酵母中的表达[J]. 江苏农业科学 2009(06)
    • [22].乳源酵母Pichia fermentans的抗氧化特性[J]. 哈尔滨工业大学学报 2010(02)
    • [23].提高Pichia stipitis乙醇耐受和抑制剂耐受能力的菌种驯化[J]. 太阳能学报 2013(04)
    • [24].诺如病毒衣壳蛋白在酵母细胞中的表达研究[J]. 社区医学杂志 2014(13)
    • [25].木聚糖酶高产菌株Pichia pastoris G12摇瓶发酵工艺的优化[J]. 新乡医学院学报 2012(04)
    • [26].一株葡萄酒Pichia sp.菌的分离鉴定及其产香成分分析[J]. 食品工业科技 2010(08)
    • [27].发酵醋醅酵母菌的分离、生长特性及分子鉴定[J]. 中国酿造 2013(02)
    • [28].Identification and characterization of Pichia membranifaciens Hmp-1 isolated from spoilage blackberry wine[J]. Journal of Integrative Agriculture 2018(09)
    • [29].川西高原冰酒发酵中Pichia anomala的鉴定与耐受性研究[J]. 中国酿造 2013(08)
    • [30].树干毕赤酵母(Pichia Stipitis)木糖还原酶(xyl1)基因克隆与序列分析[J]. 生物信息学 2011(02)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  ;  

    甘油去阻遏表型巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）的构建及其初步研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5