H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白与宿主蛋白PARP10相互作用研究

论文摘要

禽流感病毒的NS1蛋白是病毒感染宿主细胞后大量表达的蛋白,表达后主要分布在细胞核内,在成熟的病毒内并不含有此蛋白,因此NS1被称为非结构蛋白。禽流感病毒的非结构蛋白NS1能够阻止宿主细胞内mRNA的核输出,同时将宿主mRNA多聚腺苷酸帽子切下作为合成病毒RNA的引物,促进自身RNA的复制和蛋白的表达。另外,NS1通过和dsRNA相结合,抑制PKR、Jun （Jun N-terminal Kinase）/AP-1的激活,阻止干扰素的生成,进而拮抗干扰素所构成的病毒防线,这些对病毒感染和复制是有很大帮助的。为了进一步研究NS1蛋白在禽流感病毒复制及致病过程中的作用,我们采用酵母双杂交技术以H5N1型禽流感病毒NS1蛋白为诱饵蛋白寻找更多的与NS1相互作用的蛋白质。结果我们获得了一系列克隆。其中一个克隆的插入片段来自parp10 cDNA。我们进一步在酵母细胞中通过共转化实验证明了这种相互作用的特异性,同时也验证了H3N2型禽流感病毒的NS1蛋白与其的作用。PARP10是多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶（PARP）家族中一个新成员,拥有多聚腺苷酸二磷酸核糖基（PAR）催化活性,以NAD+为底物,将ADP核糖单体转移到底物蛋白上,形成直线状和多枝状的不均一聚合物,使被修饰蛋白带有大量负电荷。PARP10能够和c-myc相互作用影响细胞的增殖,有研究表明,该蛋白的表达水平过高或过低都会影响细胞的活性。PARP10还能够对核心组蛋白进行修饰,在调控染色质损伤修复及复制方面具有潜在的功能。PARP10在G1晚期被CDK磷酸化后和RNA聚合酶Ⅰ相互作用,调节rDNA的结构和重建,影响rRNA的转录。为了探究PARP10和NS1之间的相互作用以及PARP10对病毒复制的影响,我们首先提取A549细胞的总RNA,以其为模板通过RT-PCR获得了parp10 cDNA的两个片段。进一步通过重叠延伸PCR获得了parp10全长cDNA,总长度为3078bp,与GenBank公布的序列一致。其次,通过半定量PCR检测了PARP10在小鼠各组织中的转录水平,发现该蛋白在心、脑、肺、肾、肝、脾、肌肉和睾丸内都有表达,属于广泛性表达的蛋白,丰度较低,在心、肝和脾中的表达水平相对其它组织更低。在A549和293FT细胞内瞬时表达Myc-PARP10蛋白,将裂解液用Myc抗体进行免疫沉淀,发现β-actin被沉淀,利用β-actin抗体进行反向沉淀,在沉淀产物内检测到PARP10蛋白,说明瞬时表达的PARP10与β-actin共沉淀。鉴于PARP家族对UV和烷化剂造成的细胞损伤有应激反应,为此我们检测了PARP10对UV的反应,当用0.5J和1.0J的照射量进行细胞损伤后,通过抗PARP10的抗体检测到细胞内的PARP10表达量升高,而且PARP10的表达量与紫外照射的剂量呈正相关。PARP10含有RNA结合序列和核输出信号,可能参与mRNA的转运,我们在A549细胞内瞬时表达GFP-PARP10,利用CY-3标记的oligo（dT）探针进行原位杂交,发现在表达PARP10的细胞内,poly（A）RNA出现核聚集。第三,在大肠杆菌中表达了GST-NS1融合蛋白,用纯化的GST-NS1蛋白对瞬时表达PARP10的A549细胞裂解液进行pull-down,发现在细胞外NS1蛋白能够将PARP10蛋白沉淀下来。将Myc-PARP10和Flag-NS1蛋白共转染到A549细胞内进行表达,将裂解产物分别用Myc和Flag抗体进行免疫沉淀,发现PARP10和NS1能够将彼此沉淀,说明瞬时表达的PARP10和NS1在细胞内存在相互作用;通过对PARP10进行分段表达并进行免疫共沉淀实验,发现NS1作用于PARP10 C端的PAR催化结构域和谷氨酸富集区。在A549细胞内共表达GFP-NS1和RFP-PARP10,发现瞬时表达的PARP10和NS1共定位在细胞核内。第四,通过Applied Biosystems网站提供的siRNA Target Finder设计软件设计了3个parp10特异性RNA干扰片段,利用荧光蛋白酶报告基因筛选到两个有效干涉片段,其中起始于parp10 cDNA第617位核苷酸的片段抑制效率达80%以上,该片段能有效抑制瞬时表达的和内源的PARP10。在瞬时表达NS1蛋白的细胞内检测PARP10的蛋白水平和mRNA水平,发现NS1的过表达能够降低宿主细胞内PARP10的表达。MTT染色实验发现,瞬时表达的NS1和抑制PARP10的表达都能降低细胞活性,在PARP10表达被抑制时,瞬时表达NS1对细胞活性的影响更加明显。通过流式细胞检测发现在PARP10表达抑制的情况下,NS1能够改变A549的细胞周期,引起细胞在G2到M期的停滞,当增加PARP10蛋白表达量时,G2到M期的细胞含量又回复到正常水平。我们进一步研究了PARP10对H5N1亚型禽流感病毒在BHK21细胞中的复制的影响。用病毒感染瞬时表达PARP10的细胞、PARP10表达被抑制的细胞,用抗M1抗体进行检测发现,PARP10高表达时M1蛋白的量降低,而表达抑制时,M1蛋白的量增加;测定半数细胞培养物感染量（TCID50）发现PARP10高表达时病毒的量降低,而表达抑制时,病毒的量增加,与用M1抗体检测的结果是一致的,即PARP10抑制禽流感病毒在细胞中的复制。本研究首次证明了NS1蛋白与PARP10蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,初步探索了PARP10的功能,发现PARP10与β-actin有相互作用;对紫外照射产生应激反应;瞬时表达的PARP10引起poly（A）RNA的核聚集。同时探讨了NS1与PARP10相互作用的生理功能,发现瞬时表达的NS1能够降低宿主细胞内PARP10的表达;PARP10表达抑制时,NS1能够降低细胞的增殖活性,改变A549的细胞周期,引起该细胞在G2到M期的停滞;PARP10对禽流感病毒在宿主细胞内的复制具有抑制作用。总之,我们的研究揭示了禽流感病毒可能通过其非结构蛋白NS1对PARP10蛋白的抑制而促进自身的增殖。我们的工作为了解NS1蛋白的功能提供了更多的实验数据,对进一步了解禽流感病毒在细胞内的复制提供了帮助。抗病毒药物对新流感病毒的爆发将会有很好的防御作用,基于NS1蛋白能够和宿主蛋白PARP10相互作用,在病毒复制过程中担当的多种角色,将其作为抗病毒药物设计的靶位,将会扰乱NS1和细胞及病毒蛋白的相互作用,为病毒的防治提供保障手段。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 parp10 基因cDNA 的克隆及 PARP10 功能研究
• 材料和方法
• 1、材料
• 2、方法
• 2.1 A549 细胞总RNA 的提取
• 2.2 RT-PCR 扩增parp10 cDNA 的获得
• 2.3 PARP10 的小鼠组织表达谱分析
• 2.4 免疫沉淀分析PARP10 相互作用蛋白
• 2.5 免疫荧光检测PARP10 与β- actin 在细胞内共定位
• 2.6 mRNA 原位杂交检测PARP10 对细胞内mRNA 分布的影响
• 2.7 紫外损伤对A549 细胞内PARP10 表达的影响
• 2.8 Western blotting 检测目的蛋白
• 结果
• 1、RT-PCR 扩增parp10 基因全长cDNA
• 2、PARP10 在小鼠组织中广泛表达
• 3、PARP10 和β-actin 存在相互作用
• 4、PARP10 对细胞内mRNA 定位的影响
• 5、UV 对细胞内PARP10 表达的影响
• 讨论
• 第二章 H5N1 亚型禽流感病毒 NS1 蛋白和宿主蛋白 PARP10 相互作用验证
• 材料和方法
• 1、材料
• 2、方法
• 2.1 设计合成PCR 引物
• 2.2 GST-NS1 融合蛋白的表达及纯化
• 2.3 Myc-PARP10 在哺乳动物细胞内的表达和检测
• 2.4 GST 融合蛋白沉降技术检测NS1 和PARP10 相互作用
• 2.5 采用细胞共定位实验研究NS1 和PARP10 的相互作用
• 2.6 免疫共沉淀实验研究NS1 和PARP10 相互作用
• 结果
• 1、原核表达的NS1 能够沉淀哺乳动物细胞中瞬时表达的PARP10
• 2、瞬时表达的NS1 和PARP10 在哺乳动物细胞内共定位
• 3、瞬时表达的PARP10 和NS1 共沉淀
• 4、免疫共沉淀检测PARP10 与 NS1 作用的区域
• 讨论
• 第三章 NS1 蛋白和宿主蛋白 PARP10 相互作用的生理功能
• 材料和方法
• 1、材料
• 2、方法
• 2.1 parp10 基因干涉靶点的筛选
• 2.2 Western blotting 检测外源PARP10 表达抑制情况
• 2.3 MTT 染色实验
• 2.4 NS1 和PARP10 对细胞周期的影响
• 2.5 筛选能有效复制禽流感病毒的宿主细胞
• 2.6 Western blotting 检测PARP10 对病毒增殖的影响
• 2.7 测定病毒TCID50 检测PARP10 对病毒增殖的影响
• 结果
• 1、 NS1 对细胞内PARP10 表达的影响
• 2、筛选PARP10 的RNAi 有效靶点
• 3、NS1 和PARP10 对细胞活性的影响
• 4、NS1 和PARP10 对细胞周期的影响
• 5、PARP10 抑制H5N1 型禽流感病毒在细胞中的增殖
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 论著
• 个人简历
• 致谢