论文摘要
人白细胞介素-6（human interleukin-6，hIL-6）是一种多功能细胞因子，在免疫应答、造血调控和急性期反应中发挥重要作用。然而hIL-6及其受体（hIL-6R）的异常表达与许多自身免疫性疾病和肿瘤的发病机制及发展进程密切相关。因此，研制针对hIL-6的拮抗剂将可能有助于IL-6相关疾病的治疗。目前已经有hIL-6的单克隆抗体用于Ⅰ期临床试验，但还未见有特异性拮抗hIL-6功能的小分子化合物上市的报道。因此本研究基于hIL-6空间构象以及hIL-6与hIL-6R相互作用复合物的结构信息，利用计算机虚拟筛选及合理设计方法，筛选获得hIL-6拮抗先导化合物，通过生物学实验验证其活性，从而确定其中的重要官能团，为新型自主知识产权的hIL-6小分子拮抗药物的研制奠定基础。具体研究内容概括如下：1、基于hIL-6·hIL-6R复合物结构虚拟筛选小分子拮抗化合物借助（hIL-6·hIL-6R·gp130）2复合物晶体结构，利用距离几何学、分子间氢键形成理论合理确定hIL-6与hIL-6R作用的关键区域。根据hIL-6空间构象以及确定的活性区域从ACD、MDDR数据库中虚拟筛选具有潜在拮抗hIL-6功能的三类小分子化合物A、B、C。竞争ELISA初步验证三类化合物均能剂量依赖性地与hIL-6竞争结合hIL-6R。选用hIL-6增殖依赖的XG-7细胞（人多发性骨髓瘤细胞）作为筛选模型，采用MTT、3H-TdR掺入、ATPLite三种方法检测化合物A、B、C的拮抗活性，结果显示只有化合物A能抑制XG-7细胞的增殖并呈剂量依赖性，而化合物B、C没有明显的拮抗效果。在检验化合物A的细胞毒性实验中，化合物A在剂量范围内对L929与SP2／0细胞无明显毒性。Giemsa染色与DNA ladder实验表明化合物A在0.1μg／ml时就能阻断hIL-6的作用，导致XG-7细胞产生凋亡。2、hIL-6拮抗化合物的结构优化初步筛选的化合物A具有一定的拮抗hIL-6的功能，但其竞争能力、抑制活性较低。而化合物B、C尽管在细胞水平没有表现出预期的生物学功能，但在分子水平却呈现出比化合物A更好地竞争hIL-6结合hIL-6R的能力。因此以化合物A的结构为基础，同时结合化合物B、C识别hIL-6R区域特征，利用位点生长方法对化合物A进行结构优化。通过ACD、MDDR数据库的虚拟筛选及结构评价，得到化合物D。竞争ELISA结果表明，化合物D竞争结合hIL-6R的能力强于化合物A。细胞增殖抑制实验表明，化合物D能剂量依赖性地抑制XG-7及7TD1细胞的增殖，并且抑制率高于化合物A。在Giemsa染色与DNA ladder实验中，化合物D同样能阻断hIL-6的作用，导致XG-7及7TD1细胞产生凋亡，其生物学效应强于化合物A。本论文基于hIL-6空间构象、hIL-6与hIL-6R相互识别的功能域及结构特征，通过虚拟筛选、结构优化获得hIL-6拮抗先导化合物。通过生物学实验证实，获得的先导化合物能够阻断hIL-6的生物学功能。hIL-6拮抗先导化合物的获得以及对其重要官能团的确定，为进一步研发hIL-6小分子拮抗剂奠定了基础。