不同浓度维生素C对光损伤后角质形成细胞内游离Ca2+浓度的影响

论文摘要

目的:Ca2+是人体内最普遍使用的信号转导因子,在细胞生命活动中起着重要的作用,所有类型细胞的各种功能均不同程度的被Ca2+调控。阳光中的紫外线辐射是一种非常显著的环境诱变因子,对角质形成细胞的损伤作用已经明确,而维生素C的抗氧化作用也有很多研究,其重要的抗氧化作用越来越受到重视。但目前在细胞水平上,关于维生素C对角质形成细胞光损伤的干预作用机制尚不完全清楚,是否与其钙调控有关尚未见报道。本实验首先用窄谱中波紫外线（NB-UVB）对角质形成细胞进行辐射,然后给予不同浓度的维生素C,着重通过观察细胞形态、细胞活性及细胞内Ca2+浓度变化来探讨维生素C的抗氧化作用与细胞内Ca2+浓度变化的相关性。方法:角质形成细胞的分离与培养:收集我院泌尿外科青少年包皮环切术后的包皮组织,利用中性分离酶和胰蛋白酶联合消化法分离细胞,加入DMEM培养基制成细胞混悬液,转入25cm2培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养,隔天换液。原代角质形成细胞培养至15天左右细胞接近融合状态时胰蛋白酶消化,按1:3的比例传代,37℃、5%CO2培养箱中培养,次日更换培养基。以后视细胞生长情况隔天更换培养基。确定最佳辐射剂量:选择第四代对数生长期的细胞,消化后制成细胞混悬液,按1×105/ml接种于24孔培养板中,37℃、5%CO2孵箱中孵育24h,待细胞70%融合时辐射紫外线,分为8组:分别为空白对照组、30s组、1min组、3min组、4min组、5min组、6min组、8min组,每组设立三个复孔。照射后继续培养24h,倒置显微镜下观察细胞形态,并用台盼兰活细胞计数法检测细胞存活率,以细胞轻度受损,并在照射后可以很快恢复,细胞存活率在80%左右为最佳照射时间,以此确定最佳辐射剂量。分组处理:将对数生长期的细胞分别接种于6孔、24孔、96孔培养板中,待细胞接近融合时进行分组处理,实验分为以下6组:空白对照组、单纯NB-UVB损伤组、NB-UVB+0.10mmol/L维生素C组、NB-UVB+0.25mmol/L维生素C组、NB-UVB+ 0.50mmol/L维生素C组、NB-UVB+1.0mmol/L维生素C组,每组均设立3个复孔,各实验组均置于NB-UVB光源下辐射5min,然后给予不同浓度的维生素C,继续培养24h。倒置显微镜下观察细胞形态:将处理后的细胞置于倒置显微镜下观察空白对照组、单纯NB-UVB组及不同浓度维生素C组角质形成细胞的形态学变化。台盼兰染色检测细胞存活率:细胞按照上述处理方法处理,消化后制成细胞混悬液,用移液管将细胞悬液移入小试管中,加0.3%台盼兰染液浸染4min后,在倒置显微镜高倍镜下随机观察100个细胞,计数其中存活细胞数（蓝染的细胞为死亡细胞）,计算细胞存活率。MTT法检测细胞活性:孵育及照射方法同上,照射24h后各孔加入MTT,孵育4h后加入150μl DMSO,常温振荡,酶标仪492nm波长下测定各孔吸光光度值（OD值）。激光共聚焦扫描显微镜检测活细胞内游离Ca2+浓度:细胞按照上述方法处理后,加入浓度为5μmol/L的钙离子荧光探针rhod-2/AM,避光孵育30min,然后在激光共聚焦显微镜下扫描观察各组细胞的荧光强度。结果:（1）.最佳辐射剂量:以10.2mW/cm2的NB-UVB强度照射各组角质形成细胞30s、1min、3min、4min、5min、6min、8min后观察细胞形态,5min组细胞受到中等程度的损伤,但损伤也逐渐恢复,细胞存活率轻度下降,各组差异有统计学意义（P<0.05）。因此确定光照时间为5min,照射剂量为3060mJ/cm2。（2）.细胞形态学观察:空白对照组角质形成细胞呈扁平的三角形或多角形,细胞之间排列紧密,互相衔接成片,如铺路石样,各实验组细胞均有不同程度损伤,表现为细胞肿胀,严重者细胞碎片明显增多,部分漂浮于培养液中。（3）.角质形成细胞存活率:各实验组细胞存活率分别为74.6%、75.1%、81.4%、85.1%、65.6%,与空白对照组均存在显著差异,差异有统计学意义（P<0.05）;表明3060mJ/cm2的NB-UVB照射可使角质形成细胞受损,生长受抑制,不同浓度的维生素C作用后虽可改变细胞的活性,但仍然低于对照组;0.25mmol/L维生素C组、0.50mmol/L维生素C组细胞存活率较单纯NB-UVB组均有升高,差异有统计学意义（P<0.05）;而1.0mmol/L维生素C组的细胞存活率较单纯NB-UVB照射组显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）.OD值:各实验组OD值分别为0.81、0.75、0.76、0.98、0.40,与空白对照组（1.31）比较均降低,差异有统计学意义（P<0.05）;0.50mmol/L维生素C组细胞OD值较单纯NB-UVB组有显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）;1.0mmol/L维生素C组的细胞OD值较单纯NB-UVB照射组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）.各组细胞Ca2+荧光强度:各实验组荧光强度分别为54.5、55.1、54.6、40.0、7.6,与对照组（27.0）比较均有改变,差异有统计学意义（P<0.05）;NB-UVB+0.1mmol/L维生素C组、NB-UVB+0.25mmol/L维生素C组与单纯NB-UVB组比较差异无统计学意义（ P>0.05 ） ;NB-UVB+0.50mmol/L维生素C组比单纯NB-UVB组荧光强度小,差别有统计学意义（P<0.05）;NB-UVB+1.0mmol/L维生素C组的细胞荧光强度为7.6,远小于其他各组,差别均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）窄谱中波紫外线对细胞的损伤作用较小,与普通中波紫外线相比,在相同累计剂量下副作用较小,但超大剂量的窄谱中波紫外线辐射也会对细胞造成不可逆转的损伤。（2）维生素C对光损伤后的角质形成细胞具有保护作用,且这种保护作用在一定浓度下呈剂量相关性,超过一定浓度后反可加重细胞损伤。（3）细胞内游离Ca2+浓度与细胞损伤程度呈正相关,结果提示维生素C对角质形成细胞光损伤的作用机制可能与细胞内的Ca2+调控有关

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• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 角质形成细胞相关离子通道的研究进展
• 致谢
• 个人简历