膜荚黄芪肉桂酸-4-羟化酶（C4H）基因克隆及植物表达载体的构建

论文摘要

黄芪是豆科黄芪属植物膜荚黄芪（A. membrcmaceus（fisch.） Bunge.）和蒙古黄芪（A. mongholicus Bge.）的干燥根,是补气之常用中药。肉桂酸-4-羟基化酶（C4H, EC 1.14.13.11）,又称反式肉桂酸-4-单氧化酶,催化肉桂酸羟化作用产生4-香豆酸盐,是苯丙烷途径中继L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）之后的第二个关键酶。为了从分子水平上了解C4H基因的功能特性,本文从植物进化的角度出发,根据Genebank中,已有的豆科植物C4H氨基酸保守序列为基础,设计引物,通过RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends, RACE）方法克隆膜荚黄芪C4H基因,对其序列进行分析,构建了其植物表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。研究结果如下：利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术,首次从膜荚黄芪中克隆了植物次生代谢中起关键作用的C4H基因全长cDNA序列,命名为AmC4H。AmC4H cDNA全长1790bp,包括1515bp的ORF,53 bp的5’非转译区（5’UTR）,195bp的3’非转译区（3’UTR）和27 bp的polyA尾。推测其编码505个氨基酸,分子量（MV）为57.86KDa,等电点（PI）值为8.98。经同源性比较AmC4H与一些豆科植物序列高度同源。利用生物信息学方法对AmC4H基因的蛋白质基本性质行了分析预测。结果表明AmC4H为易溶、亲水性较强的蛋白,而且有两个明显的疏水峰,有两个跨膜螺旋区。信号肽存在几率是0.282,信号肽锚定几率是0.709,切割位点位于24和25位氨基酸之间。AmC4H蛋白质二级结构预测显示该基因以α-螺旋和无规卷曲为主。在此基础上,构建了植物表达载体pBI121-AmC4H,并将其转入到农杆菌中,为下一步转基因植物研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 黄芪概述
• 1.1.1 黄芪的植物学特征
• 1.1.2 黄芪资源的分布及现状
• 1.1.3 黄芪的用途及其种类
• 1.1.4 黄芪的化学成分
• 1.2 植物的次生代谢
• 1.2.1 植物次生代谢的概念
• 1.2.2 植物次生代谢产物的类型及代谢途径
• 1.2.3 植物次生代谢的生物学意义
• 1.3 肉桂酸-4-羟化酶基因的研究进展
• 1.3.1 肉桂酸羟化酶的理化性质研究
• 1.3.2 C4H基因的结构
• 1.3.3 C4H基因的表达调控
• 1.3.4 C4H研究展望
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与载体
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 培养基与缓冲液
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 膜荚黄芪总RNA的提取
• 2.2.2 总RNA质量与浓度的检测
• 2.2.3 膜荚黄芪C4H基因cDNA片段的克隆
• 2.2.4 膜荚黄芪C4H基因cDNA末端快速扩增（3'-RACE）
• 2.2.5 膜荚黄芪C4H基因cDNA末端快速扩增（5'-RACE）
• 2.2.6 膜荚黄芪C4H基因编码序列的扩增
• 2.2.7 植物表达载体的构建
• 第三章 结果与分析
• 3.1 膜荚黄芪总RNA的提取与检测
• 3.2 膜荚黄芪C4H基因经RT-PCR合成的部分cDNA
• 3.3 膜荚黄芪C4H基因的3'-RACE结果
• 3.4 膜荚黄芪C4H基因的5'-RACE结果
• 3.5 膜荚黄芪C4H基因编码序列的扩增
• 3.6 膜荚黄芪C4H基因的生物信息学分析
• 3.6.1 膜荚黄芪C4H基因全长cDNA的序列分析
• 3.6.2 膜荚黄芪C4H基因的氨基酸序列分析
• 3.6.3 膜荚黄芪AmC4H基因蛋白序列的基本性质分析
• 3.6.4 膜荚黄芪AmC4H基因编码蛋白的二级结构预测
• 3.7 植物表达载体的构建和鉴定
• 第四章 讨论
• 4.1 RNA的提取
• 4.2 膜荚黄芪C4H基因的克隆及全长cDNA序列的获得
• 4.3 膜荚黄芪C4H基因生物学信息的分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢辞