解脂耶氏酵母亲环蛋白基因的克隆及其打靶载体的构建

论文摘要

亲环蛋白（cyclophilin,CyP）家族是一类广泛存在于原核和真核生物体内,并在结构上高度保守的多功能蛋白质。该家族属于具有催化含脯氨酸的寡肽底物顺反异构作用的肽脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerases,PPIase）。CyP通过催化含肽脯氨酰的顺反异构而帮助蛋白质折叠和组装。此外,CyP还起着分子伴侣的作用,在应激反应中参与调节信号转导途径,并影响RNA的剪接过程。自最初CyP作为免疫抑制剂环孢素A（cyclosporin A,CsA）的细胞受体被发现以来,目前大约有130种CyP同源异构体被发现和克隆。CyP家族各成员间不仅分子量不同,而且在细胞分布及功能上也存在着差异。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是研究最广泛的非常规酵母之一。它能以含脂肪或蛋白质的物质作为碳源生产甲烷。在有氧的情况下,它能利用烷烃类化合物、油脂、葡萄糖等生产柠檬酸。因此,解脂耶氏酵母菌株很容易从奶制品或香肠中分离,也很容易从油田中分离。解脂耶氏酵母对人没有致病力。研究表明,在解脂耶氏酵母中含有13个CyP基因,它们分布于不同染色体上,本文选取其中1个CyP基因（GenBank登录号:YALI0C15653p）为研究对象。生物信息学分析表明该CyP含638个氨基酸,分子量约为71 Kda,pI值为5.59,可能存在于细胞质中。该蛋白含2个功能结构域（WD40和cyclophilin）,虽然与人类CyPA相似度仅为44.8%,但决定CyP结构和功能的氨基酸残基都高度保守。三维结构分析表明,解脂耶氏酵母cyclophilin的三维结构与人类CyPA的大致相同。RT-PCR分析显示CyP的表达与预期结果一致。本文成功构建了该CyP基因的打靶载体,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 概述
• 1.2 肽脯氨酰顺反异构酶
• 1.3 亲环蛋白
• 1.3.1 CyP的发现及研究
• 1.3.2 CyPA的特征
• 1.3.3 CyP的定位
• 1.3.4 CyP的生物学功能
• 1.4 解脂耶氏酵母
• 1.5 本论文的研究目的与意义
• 第2章 实验材料
• 2.1 材料
• 2.1.1 真菌材料
• 2.1.2 主要的仪器和设备
• 2.1.3 主要的酶和试剂
• 2.1.4 主要的缓冲液和试剂的成分及配制
• 2.1.5 PCR引物
• 2.1.6 使用的数据库及分析软件
• 2.1.7 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 解脂耶氏酵母CyP目的基因表达鉴定
• 2.2.2 解脂耶氏酵母CyP目的基因的克隆
• 2.2.3 解脂耶氏酵母CyP目的基因打靶载体的构建
• 第3章 结果与分析
• 3.1 解脂耶氏酵母CyP蛋白质结构的生物信息学分析
• 3.1.1 解脂耶氏酵母CyP蛋白质理化性质的分析
• 3.1.2 解脂耶氏酵母CyP蛋白质模体的分析
• 3.1.3 解脂耶氏酵母CyP蛋白质序列比对的分析
• 3.1.4 解脂耶氏酵母CyP蛋白三级结构的分析
• 3.2 核酸的提取和纯化
• 3.2.1 基因组DNA提取结果
• 3.2.2 RNA的提取结果
• 3.3 解脂耶氏酵母CyP目的基因的表达鉴定
• 3.3.1 RT-PCR
• 3.4 解脂耶氏酵母CyP目的基因的克隆
• 3.4.1 解脂耶氏酵母CyP目的基因PCR扩增
• 3.4.2 重组质粒的筛选及酶切鉴定
• 3.5 解脂耶氏酵母CyP目的基因打靶载体的构建
• 3.5.1 CyP目的基因5′端和3′的侧翼序列A和B片段的PCR扩增
• 3.5.2 pTZ18-A-Kan重组质粒的Sac Ⅰ,Kpn双酶切鉴定
• 3.5.3 pTZ18-A-Kan-B重组质粒的Sal Ⅰ,Sph Ⅰ双酶切鉴定
• 第4章 讨论
• 4.1 解脂耶氏酵母CyP蛋白信息学的分析
• 4.3 解脂耶氏酵母G418抗性基因打靶载体的构建
• 4.4 解脂耶氏酵母CyP目的基因的功能研究
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果