苹果果实酸度相关基因的筛选、克隆及表达分析

论文摘要

苹果（Malus domestica B.）是世界上最重要的鲜食和加工果品之一。苹果和以苹果浓缩汁为主的加工业成为我国加入世贸组织以后最具国际市场竞争力的优势农产品之一。我国长期以鲜食苹果栽培为主,主栽品种如富士系列、元帅系列、嘎啦系列等均偏甜而少酸,导致加工产品酸度低,出口效益较低,生产上迫切需要发展适宜加工的酸度高的品种。为了研究苹果酸度调控机制,本文利用分子标记、分析代谢关键酶和cDNA-AFLP差异显示的方法对控制果实酸度的基因进行了研究。主要结果如下:1.苹果果实酸/非（低）酸性状的SSR标记分析利用苹果上开发的140对SSR引物对东光和富士的F1代群体进行了酸、非酸性状的分子标记筛选,得到一个与果实酸性状连锁的SSR标记（CH03d12）,遗传距离为8.89 cM。共显性分析表明酸（Ma）对非酸（ma）为完全显性。2.热硼酸法提取苹果果实RNA的改良在原热硼酸法的基础上加入一些提取辅助剂并根据辅助剂的特性优化提取步骤,改良后的方法可以有效去除蛋白和多糖,从而可以从不同发育阶段的苹果果实中高效、稳定的提取高质量的RNA,所得RNA的A260/A230大于2.0,A260/A280介于1.8-2.1之间。所得RNA产量高,其中前期果实RNA产率在13.40μg/g之上,后期果实RNA产率在7.02μg/g之上。3.苹果果实细胞质型苹果酸脱氢酶（cyMDH）基因的分离及其特征利用不同物种的同源序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR技术分离了富士苹果果实中的细胞质型苹果酸脱氢酶基因,命名为Mal-cyMDH,其全长为1,246bp,GenBank注册号为DQ221207,基因组序列分析表明编码区含有7个外显子和6个内含子。推断的蛋白序列分析表明,Mal-cyMDH大部分氨基酸区域为亲水结构,有2个推测的跨膜结构区,其中在N端第9个氨基酸下游存在一个26氨基酸的强疏水结构域,这种结构也发现于其它动植物和微生物的cyMDH中。同源性比较发现,该基因的氨基酸序列与其它植物具有90%以上的同源性,尤其是与双子叶植物的同源性更高,其中与桃子的同源性最高,达到96%;与动物和微生物的同源性也在50%以上。同时在该序列中也发现了cyMDH蛋白中高度保守的NAD结合基元TGAAGQI和催化基元“IWGNH”。这都说明本

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 苹果果实酸度研究进展
• 1.2 细胞质型苹果酸脱氢酶研究进展
• 1.3 DNA 分子标记
• 1.3.1 DNA 分子标记原理及分类
• 1.3.2 SSR 标记及其在果树遗传育种中的应用
• 1.4 mRNA 差异显示技术
• 1.4.1 mRNA 差异显示技术原理及分类
• 1.4.2 mRNA 差异显示技术应用
• 1.5 苹果基因组分子生物学研究进展
• 1.6 本研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 果实可滴定酸的测定
• 2.2.2 苹果果实苹果酸含量的测定
• 2.2.3 果实酸/非酸性状的确定
• 2.2.4 模板DNA 的制备
• 2.2.5 近等基因池的构建
• 2.2.6 SSR 技术筛选与苹果果实酸/非酸性状连锁的分子标记
• 2.2.7 改良热硼酸法提取RNA 方法
• 2.2.8 CTAB 法提取RNA
• 2.2.9 RNA 含量和纯度检测
• 2.2.10 第一链含有锚定引物的cDNA 的合成
• 2.2.11 Mal-cyMDH cDNA 克隆
• 2.2.12 PCR 扩增产物的回收
• 2.2.13 PCR 回收产物的克隆
• 2.2.14 地高辛（DIG）标记的Northern blotting
• 2.2.15 地高辛标记的Southern blotting
• 2.2.16 酸度相关基因cDNA-AFLP 差异筛选
• 2.2.17 原核表达苹果果实细胞质型苹果酸脱氢酶融合蛋白及动力学参数测定
• 2.2.18 细胞型苹果酸脱氢酶活性分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 苹果果实酸度遗传的SSR 分析
• 3.1.1 果实可滴定酸在后代群体中的分布
• 3.1.2 苹果果实不同发育阶段苹果酸含量的变化
• 3.1.3 酸/低酸性状近等基因池SSR 标记的筛选
• 3.2 热硼酸法提取苹果果实RNA 的改良
• 3.2.1 方法的改良
• 3.2.2 RNA 产量和质量分析
• 3.2.3 RT-PCR 分析
• 3.3 细胞质型苹果酸脱氢酶（cyMDH）基因的克隆及表达分析
• 3.3.1 细胞质型苹果酸脱氢酶基因（cyMDH）的克隆
• 3.3.2 细胞质型苹果酸脱氢酶基因（cyMDH）的序列分析
• 3.3.3 cyMDH 的进化树分析
• 3.3.4 cyMDH 基因组序列特征分析
• 3.3.5 Mal-cyMDH 的Southern blotting 分析
• 3.3.6 高酸、低酸果实发育过程中苹果酸的变化
• 3.3.7 cyMDH 的Northern Blotting 分析
• 3.3.8 Mal-cyMDH 原核表达及动力学参数测定
• 3.3.9 高酸和低酸苹果果实中cyMDH 的酶活性分析
• 3.4 高酸、低酸基因型中苹果酸代谢关键酶的半定量PCR 分析
• 3.5 苹果果实酸度相关基因的差异筛选、克隆及表达分析
• 3.5.1 苹果果实cDNA-AFLP 技术体系的建立
• 3.5.2 苹果果实酸/低酸性状的cDNA-AFLP 的筛选
• 3.5.3 cDNA-AFLP 差异片断克隆
• 3.5.4 Mal-DDNA 的Southern blotting 分析
• 3.5.5 Mal-DDNA 的RT-PCR分析
• 3.5.6 Mal-DDNA 的Northern blot 分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢