鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶基因的发现及其克隆表达和应用研究

论文摘要

血清1型鸭疫里默氏杆菌CH-1株表达型DNA文库的免疫筛选以兔抗鸭疫里默氏杆菌阳性血清对RA血清1型CH-1株表达型DNA文库中已通过蓝白斑筛选的一个阳性克隆进行原位杂交筛选。经过5次免疫筛选后,阳性斑经过体内删除、噬菌粒经酶切分析和序列测定,得到一段4434bp的插入DNA片段,并将序列递交GenBank,获得登录号为EF030421。鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶基因的发现及其生物信息学分析运用NCBI的BLASTN、BLASTP、ORF Finder、Conserved Domains、EMBL的FASTA等程序对其中一个命名为ORF1689的开放阅读框架进行了全面的生物信息学分析。结果显示ORF1689起始密码子上游存在核糖体结合位点,完整ORF含1689bp,编码562个氨基酸（aa）,其编码蛋白的理论分子量为59.5kD,等电点为5.82。ORF1689具有phosphodiest蛋白家族的保守区域,与丙杆菌属的Caulobacter sp.K31、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）、Sphingopyxis alaskensis和Novosphingobium aromaticivorans的1型磷酸二酯酶基因的氨基酸序列同源性分别为49.283%、38.716%、38.693%和38.313%,表明该基因是一种新的1型磷酸二酯酶基因。鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶基因的原核表达及表达重组蛋白的高免血清的制备根据所提交的序列的PDE1基因段设计一对引物,从血清1型鸭疫里默氏杆菌CH-1株中扩增出PDE1基因并将其克隆到pMD18-T载体上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定之后,将PDE1基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-PDE1。重组表达质粒pET-32a-PDE1转化表达宿主菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,表达出大小约为80KD的PDE1重组蛋白。对重组蛋白进行了可溶性与不可溶性分析,结果表明表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在。同时对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度进行了优化,确定了最佳表达条件。采用镍金属螯合介质填料（Ni-NTA Superflow）对重组蛋白进行亲和层析纯化,得到高纯度的重组蛋白。以兔抗RA阳性血清进行免疫印迹检测,结果表明该重组表达蛋白具有较好的免疫原性。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆血清,并对血清进行了纯化和ELISA效价检测,为进一步研究该基因提供关键技术材料。基于PDE1重组蛋白检测RA感染的ELISA方法的建立与应用以PDE1重组蛋白为包被抗原（重组蛋白量为5ug/mL）建立了检测RA感染的ELISA方法。结果表明当OD450＞0.271时即判定为阳性,当OD450≤0.271时即判定为阴性。且该方法可以特异性地区别临床上鸭瘟病毒病、鸭乙肝病毒病、鸭病毒性肝炎病、鸭大肠杆菌病和鸭沙门氏菌病。表明该法可以作为鸭疫里默氏杆菌感染的临床诊断和检测。基于兔抗重组1型磷酸二酯酶蛋白抗体的免疫组化方法和免疫荧光方法检测RA建立和比较利用纯化的兔抗PDE1重组蛋白IgG抗体建立了检测鸭疫里默氏杆菌的间接免疫组化方法和间接免疫荧光方法。两种方法对鸭瘟、鸭源禽流感、鸭病毒性肝炎、鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鸭多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭组织进行检测,不出现阳性反应,而检测RA人工感染发病死亡雏鸭,可在心肌、肝脏、脾脏、肺脏、胰脏、肾脏、法氏囊、哈德氏腺、胸腺、脑、十二指肠、直肠、盲肠中检测到RA抗原,RA抗原主要分布于细胞浆、组织间隙和血液中。通过试验比较,间接免疫组化和间接免疫荧光检测RA抗原定位的结果基本一致,也与我实验室刘维平建立的利用抗RA全血清的间接免疫组化法检测出的规律相一致。证明了1型磷酸二酯酶基因是RA的一个标志性基因。鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶重组蛋白的免疫原性研究分别采用免疫印迹实验和攻毒保护实验对PDE1重组蛋白进行免疫原性研究。免疫印迹实验结果表明,制备纯化的兔抗PDE1重组蛋白抗体与PDE1重组蛋白能特异性地结合。将PDE1重组蛋白与等量的完全弗氏佐剂混合制备PDE1重组蛋白疫苗,分别在7日龄、14日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的凝集抗体效价,并以109PFU同源菌株血清1型RA CH-1攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、RA分离率和各组织器官的病变等级来判定PDE1重组蛋白的免疫保护效果。结果PDE1重组蛋白免疫鸭的血清中凝集抗体效价为1:32。同源菌株攻毒后表明,PDE1重组蛋白对同源菌RA CH-1的感染具有一定的保护效果。为制备RA亚单位疫苗奠定了基础。

论文目录

• 本文创新性研究工作
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述及选题目的和意义
• 第一章 鸭疫里默氏杆菌病研究进展
• 1 鸭疫里默氏杆菌病研究进展
• 2 选题目的和意义
• 第二部分 试验研究
• 第二章 血清1型鸭疫里默氏杆菌表达型DNA文库的筛选
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶基因的发现及生物信息学分析
• 1 目标序列的生物信息学分析
• 2 ORF1689蛋白质序列的生物信息学分析
• 3 结果和讨论
• 4 小结
• 第四章 鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶基因的原核表达及其高免血清的制备
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 基于重组1型磷酸二酯酶蛋白检测RA的ELISA方法的建立和应用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第六章 基于兔抗重组PDE1蛋白抗体的免疫组化和免疫荧光方法检测RA方法的建立和比较
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第七章 鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶重组蛋白的免疫原性研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三部分 结论
• 第四部分 参考文献
• 附录一 载体图谱
• 附录二 序列测定结果
• 致谢
• 作者简介