龙眼果皮过氧化物酶的分离纯化及cDNA的克隆

论文摘要

POD是影响果实褐变的一种重要的酶，目前对POD的研究还只是停留在常规生理、生化的研究上，对相关的分子生物学研究鲜见报道本试验以龙眼果皮为材料，对其中的POD进行了分离纯化、质谱分析和cDNA克隆的研究。 经过40％饱和度硫酸铵盐析、Streamline Phenyl柱、DE-52柱、Phenyl Sepharose High Performance柱、Superdex 200 prep grade柱层析，从龙眼果皮中分离得到了电泳纯的POD。SDS-PAGE结果显示，分离得到的POD亚基表观分子量约为48KD左右；精确分子量测定显示，其分子量为45.65KD；分子筛分子量测定结果显示整蛋白分子约为45KD左右，表明分离得到的POD为单体蛋白，这与之前的研究结果有很大的不同。双向电泳的结果显示了2个分子量相同而等电点不同的蛋白A和B，说明分离得到的POD实际上是2个分子量相同的混合酸性蛋白，由于这2个蛋白的分子量和理化性质十分接近而未能相互分离。 对分离得到的POD中的一个组分POD A，应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行肽指纹图谱分析，未发现能与之匹配的数据。应用电喷雾解离-四极杆-飞行时间串联质谱技术（ESI-Q-TOF2）解析了POD A的2个胰酶水解肽段的氨基酸序列，分别是：WFLSGGDWYSLF和VRESAWLD NDADLLAVP，数据库检索和比对结果显示获得的序列为氨基酸的新序列。多重序列比对结果表明其中含有一些保守的氨基酸序列。 采用同源克隆的方法，获得了龙眼果皮POD的保守区片段，并在此基础上，通过3’RACE和5’RACE，获得了龙眼果皮POD全长cDNA序列。该序列与其他植物的POD cDNA有很高的同源性。该cDNA全长1290bp，其中，5’UTR为52bp，3’UTR为238 bp，在3’UTR区域还含有典型的加尾信号AATAA和poly（A）尾。包含一个996bp的开放阅读框，编码332个氨基酸，在推导的氨基酸序列中发现了活性位点、底物结合区、血红素结合位点和钙结合位点的结构域。将串联质谱测序获得的2个肽段序列与其它植物的POD的氨基酸序列比对的结果显示：获得的肽段序列中有部分氨基酸可与开放阅读框有部分匹配，且这些匹配部分是比较保守的，分别为：E------AD-LA和SGGD----F；同时也发现m/z为1107.49的肽段在的位置在m/z为823.41的肽段的上游，这为克隆分离纯化得到的POD提供了可能。 尝试了龙眼果皮POD cDNA的原核表达。当诱导温度为40℃，IPTG浓度为1mM，

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词对照表
• 文献综述
• 1.POD的分子结构及组成
• 1.1 POD的分子结构特点
• 1.2 POD序列上的保守性
• 2.POD的反应机理
• 3.POD的分离纯化研究
• 4.POD的生理作用及其相关的分子生物学研究
• 4.1 木质化、木栓化和其它细胞壁代谢的研究
• 4.2 生长素代谢
• 4.3 创伤和病原体侵染
• 4.4 褐变
• 4.5 POD与PPO的关系
• 5.本研究的目的意义
• 第一章 福眼龙眼果皮POD的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 POD的粗酶液提取及盐析分级
• 1.3 POD过Streamline Phenyl柱分离
• 1.4 POD过DEAE-Cellulose柱分离
• 1.5 POD过Phenyl Sepharose柱分离
• 1.6 POD过Superdex 200柱分离
• 1.7 POD活性检测方法
• 1.8 电泳检测
• 1.8.1 SDS-PAGE
• 1.8.2 双向电泳
• 1.9 龙眼POD相对分子量的测定
• 1.10 精确分子量测定
• 2.结果分析
• 2.1 分离纯化结果分析
• 2.2 SDS-PAGE及分子量测定结果分析
• 2.2.1 SDS-PAGE结果分析
• 2.2.2 龙眼果皮POD的相对分子量测定结果分析
• 2.2.3 龙眼果皮POD的精确分子量测定结果分析
• 2.3 双向电泳结果分析
• 2.3.1 第一向等电聚焦（IEF）结果分析
• 2.3.2 第二向电泳结果分析
• 第二章 POD的肽指纹图谱（MALDI-TOF）分析及串联质谱（ESI-Q-TOF2）测序
• 1 材料与方法
• 1.1 样品的双向电泳
• 1.2 肽的原位酶解
• 1.3 肽段的提取
• 1.4 MALDI-TOF分析
• 1.5 ESI-QUAD-TOF2串联质谱测序
• 2 结果与分析
• 2.1 POD的MALDI-TOF分析
• 2.2 POD的Q-TOF2分析
• 2.2.1 PODA经Trypsin酶解消化后的ESI-MS分析
• 2.2.2 肽段的ESI-MS/MS测序分析
• 第三章 龙眼果皮POD的cDNA克隆与原核表达
• 1.材料与方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 福眼果皮RNA提取及总RNA含量和浓度测定
• 1.3 龙眼果皮POD cDNA保守区的克隆
• 1.3.1 cDNA的合成
• 1.3.2 RT-PCR
• 1.3.3 PCR产物的回收纯化
• 1.3.4 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.3.5 质粒的提取
• 1.4 3'RACE
• 1.4.1 3'RACE引物的设计
• 1.4.2 cDNA的合成
• 1.4.3 3'RACE
• 1.4.4 PCR产物的回收纯化
• 1.4.5 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.5 5'RACE
• 1.5.1 5'RACE引物的设计
• 1.5.2 cDNA第一链的合成
• 1.5.3 cDNA第二链的合成
• 1.5.4 5'RACE
• 1.5.5 PCR产物的回收纯化
• 1.5.6 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.6 含酶切位点ORF的扩增
• 1.7 龙眼果皮POD cDNA的原核表达
• 1.7.1 载体酶切
• 1.7.2 PCR回收产物酶切
• 1.7.3 连接
• 1.7.4 转化
• 1.7.5 阳性克隆子的筛选
• 1.7.6 测序
• 1.7.7 p29-FPOD克隆至大肠杆菌表达宿主
• 2.结果与分析
• 2.1 RNA的纯度及浓度鉴定
• 2.2 POD全长cDNA的扩增结果
• 2.2.1 保守区扩增结果
• 2.2.2 3'RACE结果
• 2.2.3 5'RACE结果
• 2.3 FPOD cDNA编码的氨基酸序列分析
• 2.3.1 FPOD cDNA编码的氨基酸与第Ⅲ类POD模型的比对
• 2.3.2 FPOD ORF推导的氨基酸与其它POD氨基酸序列比对
• 2.3.3 FPOD cDNA编码的氨基酸的性质及组成
• 2.3.4 串联质谱结果与POD氨基酸序列的比对分析
• 2.4 龙眼果皮POD cDNA的原核表达
• 2.4.1 FPOD ORF的扩增结果
• 2.4.2 FPOD cDNA插入载体pET-29a及其在E.coli.中的表达
• 第四章 小结与讨论
• 1.POD的分离纯化
• 2.POD的肽指纹图谱分析及串联质谱测序
• 3.龙眼果皮POD的cDNA克隆与原核表达
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在学期间发表的相关论文