烟草TM2 MAR序列作用机理研究及其应用

论文摘要

核基质结合区（Matrix Attachment Regions,MARs）是基因组上通常富含A/T的能够将DNA或染色质附着到核基质上的DNA序列。通过与结合蛋白的互作,MARs在维持和/或修饰DNA或染色质结构及调控相关基因方面表达中发挥重要作用。TM2是我们从烟草基因组中分离得到的一个MAR序列,在体外与核基质具有很强的结合能力,并且在水稻、烟草等转基因植株中对侧翼基因表达表现出很强的增强作用。为了进一步阐明TM2的表达调控机理,本研究对TM2在不同基因表达系统中调控侧翼基因表达的功能特点进行了详细分析,以探讨TM2可能的作用机制及其在植物基因工程中的应用。主要试验结果如下:1.在烟草转基因植株和细胞悬浮系中,双端TM2序列均能显著提高侧翼表达盒中报告基因gusA的表达水平。细胞类型对转基因表达有一定影响,但不影响TM2的调控功能。MAR序列的串联重复能够增强其表达调控作用,但增强效应与串联拷贝数不成比例。2.烟草TM2序列具有双向表达调控能力,且作用没有明显的序列方向性。无论在表达盒上游和下游,TM2均能提高侧翼基因的表达水平,表现为双向调控特性。尽管上游MAR表现出比下游MAR更强的调控作用,但双端TM2对于提高侧翼基因的表达无疑都是必要的。TM2在重组位点上正向插入和反向插入对其侧翼基因表达水平的增强作用没有显著影响,说明TM2的功能不受插入方向的影响。3.烟草TM2能够改变侧翼基因的表达水平,但不改变其启动子的表达模式。启动子缺失分析表明,TM2对侧翼基因的表达增强作用要求启动子具有调控基础表达的必需元件。无论对于组成型CaMV 35S启动子还是光合组织特异的PNZIP启动子,TM2只改变启动子的调控水平,不改变启动子调控的基因表达模式。4.TM2序列上的拓扑异构酶Ⅱ结合位点、DNA解旋结合位点和T-box均是功能元件。烟草TM2位点缺失分析表明,三种元件的缺失都会引起TM2侧翼基因表达水平的降低,是TM2 MAR的主要功能元件,但位点之间存在一定的功能冗余。5.烟草TM2序列能够显著提高侧翼启动子区对核酸酶的敏感性。微球菌核酸酶敏感试验表明,TM2显著降低了转基因植株中CaMV 35S启动子的特异扩增水平,说明TM2能够使侧翼DNA结构松散,具有局部染色质开放能力。几个功能元件对于提高核酸酶敏感性起关键作用。6.烟草TM2序列的功能不严格依赖核基质的存在,但需要在浓缩的DNA结构中才能发挥作用。在植物瞬时表达中,TM2没有明显的表达增强作用,但在酵母核外质粒表达系统中可以通过提高转录效率来增强侧翼基因的表达,几个功能元件在核外表达增强过程中同样发挥重要作用。7.通过酵母单杂交分离到几个TM2序列的潜在结合蛋白,凝胶阻滞分析表明这些蛋白能够与TM2片段进行体外结合。多种侯选靶位点暗示TM2可能有多个核基质结合位点,也间接说明TM2作用机理的复杂性。8.利用TM2序列和其他表达调控序列,构建了植物高效超表达载体和干涉表达载体,能够用于植物高效转化及转基因表达调控。利用In-Fusion Smart技术,可以将植物高效表达载体与cDNA池重组,用于大规模基因表达筛选。这些载体的构建可为植物基因功能分析提供有效的研究工具。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 核基质结合区（MAR）
• 1.1 MAR 的发现
• 1.2 MAR 的基因组学特征
• 1.3 MAR 的分类
• 2 MAR 结合蛋白（MARBP ,MAR binding protein）
• 2.1 核基质蛋白
• 2.2 转录体系组分
• 2.3 转录因子
• 2.4 其他MAR 结合蛋白
• 3 MAR 介导的调控功能的多样性
• 3.1 MAR 提供活跃整合位点
• 3.2 MAR 介导的转录水平调控
• 3.3 MAR 介导的基因表达模式调控
• 3.4 MAR 介导的染色质改构
• 4 MAR 增强基因表达的作用机制
• 4.1 MAR 介导的DNA 甲基化调控
• 4.2 MAR 介导的DNA loop 效应
• 4.3 MAR 介导的DNA 解旋作用
• 4.4 MAR 介导的核小体开放
• 5 MAR-MARBP 互作研究方法
• 5.1 MAR 的分离方法
• 5.2 MARBP 的分离方法
• 5.3 MAR-MARBP 互作分析方法
• 6 研究目的与意义
• 第一章 TM2 在植物细胞核内表达调控机制的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 烟草TM2 序列分析
• 2.2 TM2 串联重复对表达增强效应的影响
• 2.3 TM2 增强转基因表达的位置效应和方向性
• 2.4 TM2 功能对启动子的依赖性
• 2.5 TM2 几个功能位点的突变分析
• 2.6 TM2 对侧翼启动子区微球菌核酸酶敏感性的影响
• 2.7 TM2 在植物瞬时表达调控中的功能
• 3 讨论
• 3.1 TM2 对转基因的表达调控作用
• 3.2 TM2 的类增强子作用
• 3.3 TM2 的表达增强作用是一种综合效应
• 4 结论
• 第二章 TM2 在核外质粒表达系统中的异源表达调控研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 TM2 对酵母质粒表达的调控作用
• 2.2 TM2 对酵母质粒表达增强的位置效应
• 2.3 TM2 在酵母质粒表达系统中的功能区段分析
• 2.4 酵母质粒表达系统中 TM2 的位点缺失功能分析
• 2.5 TM2 对大肠杆菌质粒表达的调控作用
• 3 讨论
• 3.1 TM2 的功能与DNA 结构的关系
• 3.2 TM2 是一种广谱的类增强子序列
• 4 结论
• 第三章 TM2 结合蛋白的分离鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 烟草 TM2 序列的分段克隆及其酵母诱饵载体的构建
• 2.2 载体烟草 cDNA pool 的获得及其酵母单杂交分析
• 2.3 烟草NtRB 与TM2 的互作分析
• 2.3.1 NtRB 基因的序列分析
• 2.3.2 NtRB 蛋白的亚细胞定位分析
• 2.3.3 NtRB 蛋白的原核表达及纯化
• 2.3.4 TM2 和 NtRB 蛋白的体外互作分析
• 2.4 烟草 NtMFP 与 TM2 的互作分析
• 2.5 烟草 NtDB 与 TM2 的互作分析
• 2.5.1 NtDB 基因的序列分析
• 2.5.2 NtDB 的诱导表达及其与TM2 的体外互作分析
• 3 讨论
• 3.1 TM2 结合蛋白的多样性
• 3.2 酵母单杂交系统在MAR 功能研究中的应用
• 3.3 酵母杂交系统分析中的假阳性问题
• 4 结论
• 第四章 植物高效表达载体的构建及其应用
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 利用5′-MAR 提高转化效率
• 2.2 植物转基因高效超表达载体的构建
• 2.2.1 利用引导序列提高转基因表达水平
• 2.2.2 利用融合MAR 序列提高转基因表达水平
• 2.3 基于内源发夹结构的植物表达干涉载体的构建
• 2.4 基于外源发夹结构的植物表达干涉载体的构建
• 2.5 植物In-fusion Smart 表达载体构建
• 3 讨论
• 3.1 植物高效表达载体在转基因表达调控中的应用
• 3.2 TM2 序列在植物高效表达载体中的应用
• 3.3 植物基因功能的高通量分析
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表论文情况
• 致谢