低醇啤酒基因工程菌株的构建及其发酵参数的分析

论文摘要

低醇啤酒既具有啤酒应有的啤酒风味,又具有多饮不醉的优点,同时也符合当今消费者日益重视身体健康的消费趋势,加上妇女对酒精过敏男士对低醇啤酒的喜爱,低醇啤酒正在走俏。啤酒乙醇的含量是决定低醇啤酒的关键指标,它直接关系到啤酒的品质。如何解决啤酒中乙醇的含量是生产低醇啤酒的关键。目前,降低啤酒中乙醇含量的办法有很多种,其中最理想的方法之一就是构建低醇啤酒基因工程菌株,通过对工业用酿酒酵母本身进行改造来生产低醇啤酒。在酿酒酵母代谢过程中,控制乙醇产量的关键酶就是乙醇脱氢酶Ⅰ（ADHⅠ）,它催化代谢中的乙醛生成乙醇。乙醇脱氢酶Ⅰ（ADHⅠ）的活力大小直接关系着酿酒酵母乙醇的产量。通过对工业用酿酒酵母的改造,利用基因敲除的方法去除其自身的ADHⅠ,然后转入相对酶活力较弱的ADHⅠ基因就能够达到降低乙醇含量的目的。本研究采用LFH-PCR法从质粒pCAMBIA中扩增出两端带有与酿酒酵母ADHⅠ同源序列的潮霉素基因片段,利用醋酸锂转化法将构建的潮霉素基因片段导入工业酿酒酵母（HDY-01）中去,外源基因片段通过同源部分与酿酒酵母染色体重组并整合到染色体上,破坏了酿酒酵母的ADHⅠ基因,从而构建了ΔADHⅠ酿酒酵母。然后,根据GeneBank上登录的枯草芽孢杆菌的ADHⅠ（BADHⅠ）基因序列（CNC 000964）,设计一对引物（引物上下游带有XBaⅠ的酶切位点）,对其进行PCR扩增,将扩增得到的片断与pYC6/CT载体连接,构建表达载体pYC6/CT-BADHⅠ,利用醋酸锂转化法将表达载体pYC6/CT-BADHⅠ转入ΔADHⅠ酿酒酵母,构建低醇啤酒基因工程菌株。通过低温发酵实验,比较了HDY-01酵母,ΔADHⅠ酵母,和BADHⅠ-ΔADHⅠ酵母三株菌株的生长状况及发酵液中的乙醛、乙醇、双乙酰、残糖、悬浮酵母数、二甲基硫、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇、乙酸异戊、异戊醇等的含量。发现BADHⅠ-ΔADHⅠ酵母的生长状况比HDY-01酵母和ΔADHⅠ酵母稳定,在整个发酵的15天中能维持较多的数量,同时乙醛、乙醇、双乙酰等风味物质含量要低于HDY-01酵母,符合优质低醇啤酒标准指标。本研究的成功实现,会为低醇啤酒生产构建适合菌株,扩大了菌株来源的同时,采用的出发菌株来源于生产,改造成功后,无需更改生产设备,这样大大提高设备利用率和经济效益。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 低醇啤酒的概念、研究意义、国内外概况
• 1.1.1 低醇啤酒的概念及研究的意义
• 1.1.2 低醇啤酒国内外研究概况
• 1.2 乙醇脱氢酶的研究概况
• 1.2.1 乙醇脱氢酶
• 1.2.2 乙醇脱氢酶的应用
• 1.3 基因敲除技术在菌株改造上的研究
• 1.3.1 标记基因的应用及剔除
• 1.3.2 酿酒酵母的遗传转化系统
• 1.3.3 基因敲除
• 1.4 本论文研究的目的及意义
• 1.4.1 本论文研究的目的
• 1.4.2 本论文的意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 实验药品及配制
• 2.1.5 培养基及配制
• 2.1.6 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌（B.sub）中BADHⅠ基因的克隆
• 2.2.2 重组质粒DNA pYC6/CT- BADHⅠ的构建
• 2.2.3 ΔADHⅠ酿酒酵母菌株的获得
• 2.2.4 恢复突变酵母的获得
• 2.2.5 HDY-01酵母、ΔADHⅠ酵母、BADHⅠ-ΔADHⅠ酵母酶活力测定
• 2.2.6 遗传稳定性试验
• 2.2.7 HDY-01酵母、ΔADHⅠ酵母、BADHⅠ-ΔADHⅠ酵母发酵实验
• 第3章 结果与分析
• 3.1 BADHⅠ基因的获得结果
• 3.1.1 枯草芽孢杆菌 DNA 提取结果
• 3.1.2 PCR 扩增 B.sub 基因组中的 BADHⅠ基因结果
• 3.1.3 BADHⅠ基因片段纯化结果
• 3.1.4 连接产物pGMT-BADHⅠ转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α结果
• 3.1.5 pGMT-BADHⅠ质粒提取结果
• 3.1.6 PCR 验证pGMT-BADHⅠ质粒转化 DH5α结果
• 3.2 表达载体pYC6/CT- BADHⅠ的构建结果
• 3.2.1 pGMT-BADHⅠ的 XbaⅠ酶切结果
• 3.2.2 pYC6/CT 的 XbaⅠ酶切结果
• 3.2.3 pYC6/CT-BADHⅠ转化 E.coli DH5α结果
• 3.2.4 pYC6/CT-BADHⅠ质粒提取及 XbaⅠ酶切验证结果
• 3.3 ΔADHⅠ酵母菌株的获得结果
• 3.3.1 pCAMBIA 质粒的获得结果
• 3.3.2 带有潮霉素筛选标记的同源重组片段的获得
• 3.3.3 潮霉素杀伤曲线结果
• 3.3.4 PCR 产物直接转化酵母菌结果
• 3.4 Blasticidin 抑菌浓度的测定结果
• 3.4.1 Blasticidin 抑菌浓度的测定结果
• 3.4.2 pYC6/CT-BADHⅠ质粒转化ΔADHⅠ酵母菌结果
• 3.4.3 重组子 PCR 验证结果
• 3.5 HDY-01 酵母、ΔADHⅠ酵母、BADHⅠ-ΔADHⅠ酵母酶活力测定结果
• 3.6 遗传稳定性试验结果
• 3.6.1 传代菌株抗性检测结果
• 3.6.2 传代菌株 ADHⅠ酶活力测定结果
• 3.7 发酵参数测定
• 3.7.1 乙醛测定结果
• 3.7.2 乙醇测定结果
• 3.7.3 残糖测定结果
• 3.7.4 悬浮酵母数测定结果
• 3.7.5 双乙酰含量测定结果
• 3.7.6 二甲基硫测定结果
• 3.7.7 甲酸乙酯测定结果
• 3.7.8 乙酸乙酯测定结果
• 3.7.9 正丙醇测含量定结果
• 3.7.10 异丁醇测定结果
• 3.7.11 乙酸异戊酯测定结果
• 3.7.12 异戊醇测定结果
• 第4章 讨论
• 4.1 ADH 基因的克隆及重组质粒的构建
• 4.2 实验所用的表达系统
• 4.2.1 宿主细胞的选择
• 4.2.2 表达载体的选择
• 4.2.3 关于基因敲除技术在菌株改造上的讨论
• 4.3 实验方法的讨论
• 4.3.1 关于 ADH 基因的克隆
• 4.3.2 关于表达宿主的构建
• 4.3.3 关于基因敲除
• 4.4 关于结果的讨论
• 4.4.1 酶活力测定结果
• 4.4.2 乙醇测定结果
• 4.4.3 乙醛测定结果
• 4.4.4 双乙酰测定结果
• 结论
• 参考文献
• 致谢