家蚕正反交F1代SAGE文库的构建与分析及差异基因的时空表达谱研究

论文摘要

家蚕（Bombyx mori）是国际无脊椎动物协会唯一确定的鳞翅目模式昆虫,并具有很高的经济价值。杂交育种是选育家蚕优良品种的重要方法，家蚕性状的遗传可以分为核遗传和细胞质遗传，相同亲本间的不同杂交形式（正交或反交）其F1代的部分实用性状的遗传表现不一。实用性状是育种工作的主要目标，也是评价蚕品种优劣的主要指标，研究正反交杂交后代性状表现差异的机制，对指导育种实践，提高育种效率具有十分重要的意义。本研究以家蚕“75新×7532”和“7532×75新”（正反交）雌雄子代为材料，利用SAGE技术构建了家蚕正反交F1子代的4个SAGE文库，筛选正反交子代间具有显著性差异的基因。通过在线芯片表达谱平台（BmMDB）、NCBI的查询以及RT-PCR等试验技术，调查了具有显著性差异的表达基因在正反交子代中的时空表达谱，比较了常温和高温下5个基因的时空表达情况。并对某些在文库中具有显著性差异而没有任何注释信息的tag标签进行了GLGI的延长，以进一步挖掘有用的信息。获得主要结果如下：1.正反交子代同性别间的SAGE文库分析比较SAGE技术除了具有调查基因表达谱的作用外，对于那些低拷贝基因特别是那些未知基因的发现起到了巨大的推动作用。对正反交F1代同性别之间的文库进行比较后，筛选出具有显著性差异的基因，并对其进行上下调分析发现：与“75新×7532”雄性比较，在“7532×75新”雄性中有298个基因上调，46个基因下调；同样，在“7532×75新”雌性中有453个基因上调，240个基因下调。通过对50个丰度极高的转录本分析发现，大部分高表达的基因是看家基因，如核糖体蛋白（ribosomal proteins）、细胞骨架（cell structure）和新陈代谢相关蛋白（proteinsresponsible for metabolism）。家蚕子代的大多数基因在反交（7532×75新）F1中表现上调，同时经过差异基因的功能分析后得到参与代谢途径（metabolic pathways）和氧化磷酸化途径（oxidative phosphorylation pathway）以及信号传导途径（signaling）的差异基因在反交（7532×75新）F1中同样表现上调。据调查“7532×75新”比“75新×7532”具有更强的生命力，推测上述基因上调现象有可能与“7532×75”（反交）F1对环境的高适应性有关；另一方面，调控茧丝性状方面起作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂等基因，在正交“75新×7532”F1代表现显著上调现象，与正交“75新×7532”F1的茧丝量高于反交“7532×75新”F1相符，从某种程度暗示了“75新×7532”比“7532×75新”具有较好的产茧丝量性能。2.5个差异基因的时空表达谱从正反交F1代同性别间的SAGE比较文库中筛选出5个差异基因。线粒体硫氧还蛋白2（BGIBMGA012029）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）（BGIBMGA011438）基因在正反交雄性F1代间无明显表达差异，正交雌性F1代的表达量明显高于反交；家蚕素E-1前体（BGIBMGA000667）、抗菌肽（BGIBMGA000023）在反交雌雄F1代的表达水平显著高于同性别的正交子代；假设蛋白在反交雄性F1代的表达水平显著高于正交，但正反交雌性F1代间并无明显表达差异。为此进一步调查了这5个基因的时空表达谱。谷胱甘肽过氧化物酶（BGIBMGA011438）和假设蛋白（BGIBMGA003920）基因与BmMDB数据库（http://silkworm.genomics.org.cn）中得到的组织表达情况相符，说明这2个基因的表达没有品种特异性，也证明了本实验RT-PCR的正确性。关于家蚕素E-1前体（BGIBMGA000667）和抗菌肽（BGIBMGA000023）没有任何时空调查分析报道。这4个基因在正反交F1代的5L1d-5L7d期间表达都有先下降后上升的表达趋势。而线粒体硫氧还蛋白2（BGIBMGA012029）在BmMDB数据库的大造品种中几乎不表达，本实验中该基因在5L6d表达量明显升高。通过对5个基因分别在高温和常温下脂肪体、中肠和丝腺的表达调查分析发现，高温处理使这些基因在3个组织中的表达量几乎都发生了显著的升高，其中抗菌肽基因（BGIBMGA000023）和线粒体硫氧还蛋白基因（BGIBMGA012029）变化尤为显著，而抗菌肽基因与机体的免疫作用有很大联系；线粒体硫氧还蛋白（BGIBMGA012029）基因可以用来抵御高温引起的氧自由基的大量生成，以达到保护蚕体，维持其正常的生理生化活性。推测高温环境刺激机体使其做出相应的调整来适应高温恶劣环境。3. GLGI扩增无注释信息的差异性tag标签通过GLGI技术扩增，理论上可以得到较长核苷酸序列片段（200bp-1000bp），实验中序列片段长度相对短一些。该技术对于已建立的SAGE文库中未知基因的挖掘是一个非常高效的方法。本实验中选取了16个tag标签，最终得到12个标签的延伸序列，其中有6个标签的延长序列得到注释，还有6条标签的延长序列没有匹配上任何注释基因，而其他4个标签经过延长后没有得到任何扩增结果。这些延伸序列有助于进一步挖掘SAGE文库中的未知基因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.正反交遗传
• 1.1 伴性遗传
• 1.2 家蚕伴性遗传
• 1.3 细胞质遗传
• 2.基因差异表达研究技术
• 2.1 mRNA 差异显示及其应用
• 2.1.1 mRNA 差异显示简介
• 2.1.2 mRNA 差异显示技术在昆虫学研究中的应用
• 2.2 消减杂交技术及研究进展
• 2.2.1 消减杂交技术的应用
• 2.2.2 消减杂交技术在药物研发中的应用
• 2.2.3 SSH 技术在性别发育及肌肉品质研究中的应用
• 2.2.4 SSH 技术在环境胁迫及生物修复研究中的应用
• 2.3 基因表达系列分析（SAGE）技术
• 2.3.1 基因表达系列分析（SAGE）概念及原理
• 2.3.2 SAGE 技术的发展
• 2.3.3 SAGE 技术的数据分析
• 2.3.4 SAGE 在家蚕研究中的应用
• 第二章 研究方案
• 1 研究目的与意义
• 2 研究内容
• 3 技术路线
• 第三章 基本实验方法
• 1 常用材料与试剂
• 1.1 蚕品种与菌种
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 缓冲液和常用溶液
• 1.5 核酸电泳相关试剂
• 1.6 生物信息学资源及分析软件
• 2 主要仪器设备
• 3 基本实验方法
• 3.1 总 RNA 的抽提
• 3.2 RNA 反转录
• 3.3 PCR 扩增反应程序及扩增体系
• 3.4 PCR 产物的回收与连接
• 3.5 感受态细胞制备
• 3.6 连接产物的转化
• 3.7 重组质粒的筛选
• 3.8 碱裂解法少量制备质粒 DNA
• 3.9 酶切反应
• 第四章 家蚕正反交 F1 代 SAGE 文库的构建与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 生物材料与仪器
• 1.2 RNA 的抽提及 mRNA 的分离
• 1.3 SAGE 文库的构建
• 1.4 标签分析和注释
• 1.5 差异基因的鉴定和功能分析
• 1.6 差异基因的功能分析
• 2 结果与分析
• 2.1 家蚕正反交 F1 代的 SAGE 文库基本信息
• 2.2 家蚕正反交 F1代差异基因分析
• 2.3 家蚕正反交 F1代显著性差异基因的功能分析
• 2.4 家蚕正反交 F1代显著性差异基因的 Pathway 分析
• 3 讨论
• 第五章 差异基因的时空表达研究
• 1 材料和方法
• 1.1 试验取材
• 1.2 所用引物
• 2 结果与分析
• 2.1 高温条件下线粒体硫氧还蛋白 2（BGIBMGA012029）的时空表达
• 2.2 高温条件下谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）（BGIBMGA011438）的时空表达
• 2.3 高温条件下家蚕素 E-1 前体（BGIBMGA000667）时空表达
• 2.4 高温条件下抗菌肽（BGIBMGA000023）时空表达
• 2.5 高温条件下假设蛋白（BGIBMGA003920）时空表达
• 2.6 三个组织中 5 个基因在高温和常温下的表达分析
• 2.6.1 高温和常温下 5 个基因在脂肪体中的表达分析
• 2.6.2 高温和常温下 5 个基因在中肠中的表达分析
• 2.6.3 丝腺中 5 个基因高温和常温下的表达分析
• 3 讨论
• 第六章 家蚕正反交 SAGE 文库中部分标签延长
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 生物材料
• 1.1.2 标签延伸
• 1.2 方法
• 1.2.1 双链 DNA 的合成原理
• 1.2.2 双链 DNA 的合成过程
• 1.2.3 标签（CATG 识别位点）酶切
• 1.2.4 磁珠吸附
• 1.2.5 加 Adapter A 接头
• 1.2.6 PCR 扩增
• 1.2.7 DNA 克隆、鉴定及测序
• 1.2.8 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA 的提取及质量测定
• 2.2 双链 cDNA 合成及酶切
• 2.3 GLGI 扩增结果
• 2.4 序列分析
• 3 结论与讨论
• 第七章 综合结论
• 1 基于 SAGE 文库的正反交差异表达基因的比较及筛选
• 2 反交子代大多数基因的上调与其对环境适应能力较高有关
• 3 正反交差异基因的时空表达谱
• 4 无注释信息的差异性 tag 标签 GLGI 扩增延长
• 参考文献
• 研究生期间发表的文章、专利
• 致谢