论文摘要
目的通过观察肾脏缺血再灌注中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、足细胞形态学及其相关蛋白分子nephrin、podocin表达变化,探讨AngⅡ在肾脏缺血再灌注足细胞损伤中的作用及其可能机制,为其预防和治疗提供新的靶点。方法(1)取健康雄性SD大鼠,通过夹闭双侧肾动脉制作肾脏缺血模型,60分钟后恢复肾脏血流,并于再灌注30分钟,1小时,3小时,6小时,12小时,24小时后分别处死动物,苦味酸法检测血清肌酐、ELISA法检测血清及肾组织中AngⅡ含量,并行光镜及电镜观察肾组织形态学损伤。(2)根据电镜结果在足细胞损伤最严重时间点加用AngⅡ的1型受体阻断剂(ARB)氯沙坦灌胃治疗,检测肾功能、电镜观察肾组织足细胞损伤、免疫荧光及Westernblot检测肾组织nephrin、podocin表达,同假手术组,缺血组,缺血再灌注组比较,观察上述指标变化。(3)体外培养人肾小球足细胞,观察其生长特点并经间接免疫荧光法检测细胞上nephrin、podocin的表达。通过在培养箱中通入高浓度氮气制作细胞缺氧复氧模型,ELISA法检测细胞上清液中AngⅡ含量变化。(4)模拟缺血再灌注模型体内环境变化,直接在足细胞培养基中加入AngⅡ刺激,并分别给予ARB及蛋白激酶C抑制剂(PKCI)干预,观察各组细胞形态学改变,Western blot检测足细胞PKC活性变化,流式细胞仪检测细胞nephrin、podocin表达。结果(1)缺血组大鼠血清肌酐上升,同假手术组相比有统计学意义。再灌注后血清肌酐进一步升高,1小时达高峰,6小时后开始逐渐下降,24小时恢复至正常水平。缺血后血清及肾组织中AngⅡ含量也升高,同假手术组相比有统计学意义。再灌注后血清中AngⅡ即开始下降,但组织中AngⅡ含量仍维持在高水平并可持续至再灌注后24小时。光镜下缺血再灌注组织主要表现为小管间质损伤,肾小球无明显改变。电镜下再灌注组可看到足细胞足突融合,部分脱落,以1小时及3小时最为严重,6小时后逐渐恢复。免疫荧光及Westernblot检测缺血再灌注组织中nephrin、podocin表达明显减少,且存在分布异常。(2)氯沙坦治疗组血清肌酐明显下降,且足细胞损伤减轻,nephrin、podocin表达有所恢复,同缺血再灌注组相比有统计学意义。(3)体外培养的人肾小球足细胞呈现两种状态,在33℃条件下细胞胞体较小,鹅卵石状,生长速度快,呈现增殖状态,具有双核的特点;从33℃转移到37℃后,足细胞增殖能力明显减弱,胞体逐渐增大,细胞开始长出细小足突,之后这些足突会逐渐长长,细胞呈现星形。随时间延长,细胞完全失去增殖能力,胞体继续变大,足突进一步伸长呈树枝状。在两周左右细胞完全分化成熟,不同细胞之间的足突会相互接触。经间接免疫荧光检测可见到细胞表面有nephrin、podocin表达。在培养箱中通入高浓度氮气制作细胞缺氧模型,在复氧后1小时及3小时检测,细胞上清液中AngⅡ含量有所上升,但同对照组相比,无明显统计学意义。(4)体外培养人肾小球足细胞对AngⅡ呈现剂量依赖毒性,随AngⅡ浓度升高,足细胞存活率逐渐降低,台盼蓝及LDL释放实验显示,AngⅡ浓度为100nmol/L时细胞死亡率小于5%,因此我们选择100nmol/L作为AngⅡ的刺激浓度。在AngⅡ刺激组,HE及Gimsa染色可见到细胞失去原有形态,变小变圆,核浓缩,Western blot结果显示足细胞胞膜PKC与胞浆PKC比值升高,活性增强,流式细胞仪检测细胞nephrin、podocin荧光强度明显减弱。给予ARB及PKCI干预抑制了细胞中PKC的激活,异常形态的细胞减少,nephrin、podocin的表达也有所恢复。结论肾脏缺血再灌注过程中存在有足细胞的损伤。AngⅡ参与了这一过程,给予其1型受体阻断剂(ARB)可减轻缺血再灌注导致的足细胞损伤。AngⅡ对足细胞的损伤作用部分由PKC信号转导通路介导,给予ARB及PKCI可抑制PKC的活性,使足细胞相关的功能性蛋白nephrin、podocin表达有所恢复,起到一定的足细胞保护作用。