萍乡红鲫卵膜糖蛋白ZP3基因的克隆与表达

论文摘要

萍乡红鲫（Pingxiang red-transparent crucian carp,Carassius auratus var.Pingxiangnensis）是在江西省萍乡地区分布的天然三倍体鲫突变体经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代,具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。卵透明带（zona pellucida,ZP）,是围绕在卵外周的细胞外糖蛋白基质,ZP3是ZP家族的成员之一。实验表明,ZP3是初级精子受体,在哺乳动物中已被证实具有结合精子并引发顶体反应的功能,其O-连糖基化侧链在精子结合中起关键作用。本论文主要内容分为两部分:一、采用SMART cDNA合成和RACE-PCR技术扩增萍乡红鲫ZP3基因的cDNA序列,克隆得到的cDNA序列长度为1278bp。该序列具有完整的3′端,包含终止密码子TAA,加尾信号AATAAA以及30bp的poly（A）尾巴。其中16-1230bp为ZP3的部分开放阅读框,编码404个氨基酸残基。比较萍乡红鲫、银鲫、普通鲤鱼、彩鲫和普通鲫鱼ZP3氨基酸序列同源性,结果表面萍乡红鲫和银鲫之间的同源性最高,提示在进化中,二者的亲缘关系可能很近;二、将萍乡红鲫ZP3 cDNA核心片段克隆到表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21（DE3）,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,表达出ZP3融合蛋白,用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物,并通过SDS聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测和鉴定,最后采用Bradford法对纯化的蛋白进行定量。结果得到较为纯化的ZP3融合蛋白,其分子大小约为31KDa,浓度为3.588mg/ml。为下一步ZP3抗体的制备以及进一步研究萍乡红鲫ZP3在卵子发生过程中的表达特征奠定基础。同时也为从精卵识别与早期结合的角度深入研究萍乡红鲫受精过程,探索鱼类受精过程中的精卵识别机制提供有价值的基础资料,并为其繁殖、养殖指导生产提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 鱼类的配子发生及受精生物学
• 1.1.1 鱼类的配子发生
• 1.1.2 鱼类的受精生物学
• 1.2 鱼类的雌核发育（gynogenesis）生殖方式
• 1.3 三倍体萍乡红鲫遗传背景与雌核发育生殖方式的初步研究
• 1.4 卵透明带ZP3与受精作用的研究概况
• 1.5 本研究的内容、目的及意义
• 第2章 萍乡红鲫ZP3基因SMART cDNA的合成
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 主要仪器和设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 萍乡红鲫总RNA的提取
• 2.1.5 SMART cDNA的合成
• 2.1.6 随机引物设计及ZP3中间序列的获得
• 2.1.7 RACE-PCR扩增
• 2.1.8 RACE产物切胶回收
• 2.1.9 RACE产物的克隆与鉴定
• 2.1.10 ZP3 cDNA序列拼接及同源性分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 萍乡红鲫总RNA提取结果
• 2.2.2 ZP3中间片段PCR扩增结果
• 2.2.3 RACE-PCR产物及目的片段切胶回收结果
• 2.2.4 RACE产物T-A克隆的鉴定
• 2.2.5 萍乡红鲫ZP3 cDNA序列拼接与分析
• 2.2.6 萍乡红鲫ZP3同源性分析
• 2.3 讨论
• 第3章 萍乡红鲫ZP3基因的克隆表达与纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料及主要仪器和试剂
• 3.1.2 特异性表达引物的设计
• 3.1.3 表达片段的PCR扩增
• 3.1.4 PCR产物切胶回收
• 3.1.5 pGEM-T-ZP3质粒的构建与鉴定
• 3.1.6 重组表达质粒的构建及诱导表达
• 3.1.7 亲和层析纯化表达的蛋白
• 3.1.8 Bradford法测定蛋白质浓度
• 3.2 结果
• 3.2.1 目的表达片段PCR扩增结果
• 3.2.2 PCR产物回收结果
• 3.2.3 pGEM-T-ZP3重组质粒的双酶切鉴定
• 3.2.4 目的蛋白的诱导表达
• 3.2.5 ZP3融合蛋白的纯化
• 3.2.6 ZP3融合蛋白的浓度测定
• 3.3 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间的研究成果