论文摘要
目的:肺癌是严重危害人民生命和健康的常见病,目前国内外肺癌的发病率和死亡率还在不断上升。肺癌在城市占男性恶性肿瘤死亡的38.08%,女性的16%,均居首位。目前世界上均倾向于将两类生物学行为不同的肺癌分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞性肺癌（NSCLC）。尤其是NSCLC治疗效果多年来一直没有显著提高,其原因一方面由于其生物学特性十分复杂、恶性程度高且多药耐药。另一方面关键还在80%的NSCLC患者确诊时已属晚期而失去手术机会。所以化疗在NSCLC的治疗中是无可取代的,但多药耐药的出现令人沮丧,以致目前NSCLC的联合化疗有效率仅20%—40%。于是,我们设想将转基因技术与放射性核素治疗相结合,将hNIS基因转染至人NSCLC中的大细胞肺癌H460细胞系中,使原本不摄碘的H460细胞摄取碘。然后利用放射性核素——131I的辐射生物效应,干扰H460细胞的生物代谢,抑制肿瘤细胞增值活性,最终使癌细胞死亡。方法:1.鉴定已构建好的重组质粒（pcDNA3.1-hNIS）。使用脂质体转染法利用重组质粒将hNIS基因转染入人大细胞肺癌H460细胞系中,使H460细胞获得hNIS基因;经过抗生素G418筛选获得稳定表达hNIS的细胞系（hNIS-H460）,同时设立对照组（H460）;进行体外摄125I实验及过氯酸盐抑制实验;体外125I反流实验,体外125I内流实验,并绘制时间—分钟放射性计数曲线等。2.用稳定表达hNIS的细胞株hNIS-H460以107/0.1mL的浓度接种裸鼠肩胛部皮下,同时对照组在相同位置以相同浓度接种野生型H460细胞,建立大细胞肺癌荷瘤裸鼠模型,接种同时开始在裸鼠饮水中加入优甲乐（L-T4）5mg/L施行甲状腺封闭;接种后2周裸鼠皮下移植瘤直径约达到15mm,腹腔内注射99mTcO4-进行放射性核素99mTcO4-显像;腹腔内注射125I,测定其在裸鼠移植瘤及不同脏器的分布情况;腹腔内注射131I,进行显像,并观察131I作用下,转染组和对照组裸鼠大细胞肺癌移植瘤体积和病理形态学的变化情况,研究131I对hNIS转染的裸鼠大细胞肺癌移植瘤的治疗作用。结果:1.以BglⅡ单酶切并电泳鉴定酶切产物,结果显示重组质粒（pcDNA3.1-hNIS）在5502bp和1922bp有两清晰电泳条带,与理论计算结果相符合,可以证实本次质粒确实为重组质粒（pcDNA3.1-hNIS）。2.使用脂质体转染法转染hNIS基因后,经G418筛选后获得稳定表达细胞系（hNIS-H460）,其G418耐受浓度为700μg/ml;对照组细胞系（H460）完全没有G418抗性。3.瞬时表达hNIS的H460细胞的摄125I能力测定:使用脂质体转染24h后,hNIS在H460细胞系中有瞬时表达,实验组（hNIS-H460）比较对照组（H460）的摄125I能力增高3.04倍（P＜0.05）。4.125I内流的动态演变实验:125I在实验组稳定表达细胞系（hNIS-H460）中快速聚集,约60-90min时达到稳定阶段;对照组（H460）没有125I的聚集。5.稳定表达细胞系（hNIS-H460）的摄125I能力测定:实验组（hNIS-H460）比较对照组（H460）的摄125I能力增高50.97倍（P＜0.05）。6.125I外流的动态演变实验:实验组（hNIS-H460）在环境中撤掉125I后,细胞中的125I会发生快速外流;实验组（hNIS-H460）中125I的生物半衰期为6min,有效半衰期为6min。7.过氯酸盐抑制实验:没有加入NaClO4的hNIS-H460细胞的有摄125I能力,加入NaClO4的hNIS-H460细胞的摄125I能力明显受到抑制,摄碘能力降低50.31倍（P＜0.05）,证明hNIS-H460的摄碘功能确实为hNIS基因的功能。8.建立裸鼠大细胞肺癌荷瘤模型,施行甲状腺封闭,裸鼠皮下移植瘤直径约达到15mm时,转染组移植瘤可以应用核医学显像系统进行放射性核素99mTcO4-显像,而对照组移植瘤则不显像。9.大细胞肺癌荷瘤裸鼠摄取125I的体内脏器分布定量实验:转染组移植瘤摄取放射性核素125I能力比对照组增高7.91倍（P＜0.05）,L-T4封闭后的甲状腺摄取125I能力比其他脏器高4.37倍,而其他脏器摄取125I能力均较弱,与对照组无明显差异,略高于本底水平。10.放射性核素131I治疗作用观察:进行放射性核素131I显像,可见转染组裸鼠移植瘤部位有131I浓集,而对照组无此现象。观察131I对hNIS转染的裸鼠大细胞肺癌移植瘤的治疗作用,结果显示在131I作用下,对照组肿瘤继前迅速生长;而转染组肿瘤治疗后生长减慢,从第2周初起肿瘤体积缩小。结论:本研究使用质粒将hNIS基因转染入不摄碘的大细胞肺癌H460细胞系中,使原来不摄碘的大细胞肺癌细胞摄碘,然后利用放射性碘元素的辐射生物效应,使肿瘤细胞死亡。在体外及体内条件下均证明转染hNIS基因,可介导131I有杀伤肿瘤细胞并提示hNIS基因转染结合放射性核素99mTcO4-显像和131I治疗可为非甲状腺源性肿瘤开辟全新的诊治途径,具有广阔的临床应用前景。
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相关论文文献
- [1].pEGFP-C3-hNIS重组质粒的构建及其在人胃癌BGC-823细胞的表达[J]. 山东医药 2011(52)
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