论文摘要
本研究以位于Nogo分子Reticulons同源区的Nogo-66为诱饵蛋白,酵母双杂交筛选成人脑cDNA文库,获得了Necdin、GAPDH和TRAP-δ亚基等候选结合蛋白。通过β—半乳糖苷酶活力检测和免疫共沉淀,验证了这些蛋白与Nogo-66在酵母中确实存在结合。将Necdin缺失突变后进行β-半乳糖苷酶活力定量检测发现,Necdin蛋白中间段MAGE同源区两侧氨基酸序列对Necdin与Nogo-66间的结合至关重要。 筛选获得转染Nogo-A的HEK293稳定株,以此稳定转染细胞株和动物组织进行免疫共沉淀同样可以检测到Necdin、GAPDH与Nogo-A两者间的结合。脊髓背根神经节和海马神经元进行免疫荧光染色后激光共聚焦扫描显微镜观测结果发现,Necdin、GAPDH与Nogo-A在神经元胞浆区和突起中高度共存。以上结果表明Necdin、GAPDH与Nogo-A存在生理性结合。 将Nogo-A与Necdin共转染HEK293细胞后进行免疫荧光染色发现,Nogo-A可以将Necdin滞留在胞浆区从而减少其入核。细胞分化观察显示,过表达Nogo-A明显抑制Necdin对PC12细胞的促分化作用,提示Nogo-A与Necdin间的结合可能参与调节Necdin对PC12细胞的促分化作用。
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标签：酵母双杂交论文; 结构域论文; 激光共聚焦扫描显微镜论文;