hEGF-Dybowskin-2CDYa融合多肽的表达纯化与功能研究

论文摘要

抗菌肽Dybowskin-2CDYa（accession no.:EU827809）是在本实验室前期工作中从东北林蛙皮中分离鉴定得到的一条新型富含精氨酸的阳离子多肽（SAVGRHGRRFGLRKHRKH）,该抗菌肽由18个氨基酸残基组成,预测分子量为2154.2,等电点为12.60,带有10个正电荷。该肽是一条新型肽,不同于已报道的蛙类抗菌肽,具有正电荷多、等电点高、亲水性强等特点。前期研究结果表明Dybowskin-2CDYa抑菌活性性高、溶血活性低,有望开发成为一种新的肽类抗生素药物。人表皮生长因子（hEGF）是促生长因子家族成员之一,能够强有力的促进细胞增殖分化,是上皮细胞、表皮细胞和间充质等敏感细胞的丝裂原。迄今,hEGF重组蛋白被广泛用于皮肤烫伤烧伤、角膜损伤及胃溃疡等方面且效果明显。在新生血管形成、促进表皮细胞的增殖以及刺激神经细胞分化等方面具有显著的作用,因此可用于治疗创伤、烧伤以及加速伤口愈合等疾病。本实验室前期研究中已经获得抗菌肽Dybowskin-2CDYa和hEGF融合肽基因序列,成功构建融合肽的原核表达重组质粒pET30-hEGF-Dybowskin-2CDYa，并通过IPTG诱导成功表达稳定的新型融合多肽,本文优化了融合多肽的表达条件,并对表达产物进行了分离纯化和功能研究。表达水平受诱导培养基的组成、诱导温度、PH、IPTG浓度、诱导时间、培养基体积、通气量等条件影响。本实验在其他条件一致的情况下,对诱导时间、IPTG浓度、诱导温度对表达水平的影响进行优化,研究最佳发酵工艺。通过最佳发酵工艺条件和低温长时间诱导表达,收集菌体,超声破碎,12000rpm离心收集上清和沉淀,12%SDS-PAGE分析,低温表达,判断融合多肽的表达形式。将收集的包涵体进行清洗、溶解、复性处理后,利用His标签进行亲和层析纯化、除盐,为确保在冷冻干燥过程中融合多肽保持其生物活性,在纯化样品中添加冻干保护剂,并通过复溶检测抑菌活性,优选得到最佳保护剂,并测定MIC。同时采用MTT方法和细胞划痕方法检测融合多肽的促3T3生长活性。研究结果:在其他条件一致的情况下,在37℃、IPTG 1mmol/L条件下发酵4h达到最佳效果,融合蛋白以包涵体形式表达,平均1L发酵液纯化后得到7g菌体及0.2～0.3g蛋白干粉,最佳保护剂为甘氨酸。纯化蛋白复性后进行抑菌活性实验,显示出对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌良好的抑制活性,对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为8μg/ml、8μg/ml、4μg/ml。MTT实验及细胞划痕实验结果显示融合多肽在一定浓度范围内具有促细胞增殖和迁移的作用,证明融合多肽具有促伤口愈合的生物活性。本文通过获得具有活性的融合多肽为研究抗菌肽Dybowskin-2CDYa的结构功能及抑菌机制奠定了物质基础物质,并为下一步研究融合多肽的皮肤修复功能与新药的开发奠定理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 引言
• 0.1 概述
• 0.2 抗菌肽的分类及结构特点
• 0.2.1 α-螺旋结构类
• 0.2.2 开放性螺旋结构类
• 0.2.3 β-折叠型
• 0.2.4 环链结构类
• 0.3 抗菌肽的作用机制
• 0.3.1 胞外作用机制
• 0.3.2 胞内作用机制
• 0.3.3 对真核细胞无影响的原因
• 0.4 抗菌肽的生物学活性
• 0.4.1 抗菌肽对细菌的作用
• 0.4.2 抗菌肽对病毒的作用
• 0.4.3 抗菌肽对真菌的作用
• 0.4.4 抗菌肽对原虫的作用
• 0.4.5 抗菌肽对抗肿瘤作用
• 0.4.6 溶血活性
• 0.4.7 其他生物学功能
• 0.5 抗菌肽的应用前景
• 0.5.1 食品工业及食品保藏应用前景
• 0.5.2 药用及临床应用前景
• 0.5.3 畜牧水产养殖业应用前景
• 0.5.4 农业工程应用前景
• 0.6 抗菌肽基因工程表达策略
• 0.6.1 表达系统的选择
• 0.6.2 人表皮生长因子
• 0.6.3 表达策略
• 0.7 表达纯化
• 0.7.1 包涵体的洗涤
• 0.7.2 包涵体的变性溶解
• 0.7.3 影响包涵体复性的物理因素
• 0.7.4 包涵体复性方法
• 0.8 冻干保护剂
• 0.8.1 糖类
• 0.8.2 氨基酸
• 0.8.3 多羟基化合物
• 0.8.4 蛋白质
• 0.8.5 聚合物
• 0.8.6 其他类型的保护剂
• 0.9 本文目的和意义
• 第一章 hEGF-Dybowskin-2CDYa融合多肽的表达工艺优化
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 菌株
• 1.2.2 实验试剂
• 1.2.3 主要仪器
• 1.2.4 溶液和培养基配制
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 阳性重组子的摇瓶水平活化与诱导
• 1.3.2 诱导产物的SDS-PAGE分析
• 1.3.3 发酵工艺优化
• 1.3.4 表达产物的确认
• 1.4 结果
• 1.4.1 诱导表达产物的SDS-PAGE分析
• 1.4.2 表达工艺优化
• 1.4.3 融合多肽的表达方式分析
• 1.5 讨论
• 第二章 融合多肽hEGF-Dybowskin-2CDYA的纯化与功能研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 实验主要仪器
• 2.2.4 溶液与培养基的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 包涵体的处理
• 2.3.2 镍离子亲和层析分离纯化
• 2.3.3 蛋白的纯化处理
• 2.3.4 纯化产物的Western Blot鉴定
• 2.3.5 融合多肽对NIH3T3细胞增殖的影响
• 2.3.6 划痕实验检测融合多肽对NIH3T3细胞迁移的影响
• 2.3.7 纯化产物的抑菌活性检测
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 洗脱条件分析
• 2.4.2 冻干保护剂初步筛选
• 2.4.3 Western Blot鉴定分析
• 2.4.4 NIH3T3细胞增殖分析
• 2.4.5 融合多肽对NIH3T3细胞增殖的时间效用
• 2.4.6 细胞划痕实验结果
• 2.4.7 纯化产物活性检测分析
• 2.5 小结
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况